Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD

Molekulární biologie * 50. léta 20. století popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick) stavba a vztah biomolekul k funkcím a vlastnostem organizmů

Genetické markery genetické markery = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím morfologické markery (barva květu) biochemické markery (přítomnost určitých látek v rostlině podmiňují geny -> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu) molekulární markery (analýzy DNA ) DNA markery

Molekulární markery umožňují identifikaci organizmu stanoví příbuzenské vztahy Výhoda DNA markerů: rychlá a spolehlivá determinace

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism (polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů) základní princip metody štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky přenos fragmentů na membránu hybridizace DNA

Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus) rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp EcoRI - AluI -

Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly , resp. fragmenty DNA, podle jejich délky princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek výsledek není pouhým okem patrný, a proto se gel, na němž elektroforéza probíhá, musí specificky barvit a vizualizovat u dlouhého genomu tvoří výsledek souvislá šmouha na níž jednotlivé fragmenty nerozlišíme a tím pádem je jakákoliv případná analýza genomu vyloučena

Přenos fragmentů na membránu fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda) renaturace - proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken hybridizace – renaturace s dvojím původem jednořetězcové DNA membrána s navázanou DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně značena, tzv. sonda sonda je krátká (150 - 8000 bází) a homologická (alespoň z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo sonda se navazuje jen na místa s komplementárním řetězcem po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

Pattern elektroforetický profil (pattern)

Interpretace RFLP porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA pattern restrikční mapa - náročná záležitost studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

Zhodnocení metody RFLP KLADY vysoká reprodukovatelnost pattern vysoká interpretovatelnost ZÁPORY náklady bezpečnost práce (radioaktivní materiál) velké množství DNA množství sondy vysoce kvalifikovaný personál

PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) - vyvinuto v 80. letech 20. století - jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky základní princip metody in vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech fragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelu možno analyzovat i velmi malé množství DNA Polymerázová řetězová reakce byla vyvinuta v 80. letech minulého století a dnes představuje jednu z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky. Podstatou této vysoce účinné metody je in vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech. Výsledkem je získání mnohonásobného počtu kopií daného úseku DNA. Získané amplifikované fragmenty lze následně separovat a vizualizovat pomocí elektroforézy. Nejcitlivějším typem elektroforézy je tzv. kapilární elektroforéza. Pomocí těchto metod je možné analyzovat i velmi malé množství DNA, tedy i DNA obsaženou v jediné buňce.

PCR - teplotní fáze 1. teplotní fáze 95 °C - denaturace zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí) 2. teplotní fáze 35 - 65 °C – annealing ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA 3. teplotní fáze 72 °C – polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´  3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

Průběh PCR daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2n = počet fragmentů po n cyklech) v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje namnožený vzorek DNA se elektroforeticky zpracuje, čímž se zjistí délka fragmentů, z nichž se vzorek skládá (fragmenty jsou stejně dlouhé a vytvoří dobře zachytitelný proužek) výsledek elektroforézy není pouhým okem patrný, proto se DNA specificky barví EtBr (ethidium bromidem), který se díky své struktuře vloží dovnitř dvoušroubovice a po ozáření UV světlem oranžově fluoreskuje, zmíněné se fotografuje a dále hodnotí výstupy PCR nacházejí významné uplatnění v taxonomii a populační biologii poznámka: billion je v češtině miliarda

Zhodnocení metody PCR KLADY levnější a technologicky snazší oproti RFLP malé množství zpracovávané DNA ZÁPORY vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA jedná se o modifikaci PCR Nevyžaduje znalost cílové sekvence DNA Významná pro systematickou a populační biologii

Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR     Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší (40 - 45 cyklů))

Zhodnocení metody RAPD KLADY použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom technologicky jednoduchá a rychlá metoda výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování) ZÁPORY nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace) lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)

Molekulární markery v lesnictví Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod.) Příbuzenské vztahy a původ Deklarace vlastností sadebního materiálu Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy

Nejvýznamnější zdroje informací www.ueb.cas.cz/download/manual.rtf http://www.silvarium.cz/lesprace/03/01/clanek12_vyzkum.html http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery3-DNA,PCR,RAPD.pdf http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery5-RFLP,cpDNA.pdf

Děkujeme za pozornost.