HPLC High Performance Liquid Chromatography Nejdokonalejší LC: účinnost N>104; Rf = ≥ 10-2 Detekční limit 1 : 109 -1015 Použití: analytické - ng x preparativní – 100g Vysoká reprodukovatelnost Vyšší T I netěkavé látky Vznik  Teorie Přístrojová technika (GC, detektory) Sorbenty

Srovnání HPLC a LC   Průměr částice (silikagel) (μm) 3 ± 1; 5, 8 ± 2   Průměr částice (silikagel) (μm) 3 ± 1; 5, 8 ± 2 5 – 500 Průtok (ml/min) 1 – 20 (30) 0,2 Tlak (MPa) 1- 40 (60) 0,1 Teplota ≤ 70o r.t. Průměr kolony (mm) 2 – 8 (103 ) 10 – 40 (200)

HPLC chromatograf

Peristaltické čerpadlo Tok: 0.01 – 10.0 (max.30) ml/min Tlak: 28 - 42 MPa Výhody: Jednoduchá konstrukce Sterilita Ne styk FM s kovem Nevýhody: Tlakové rázy  Druhé čerpadlo s opačným rázem

Short Column Chromatography Biotechnologické provozy

CoulArray – elektrochemický detektor 4,8,12 nebo 16 senzorů v serii Potenciálový rozsah ± 2 V v 1 mV krocích Pracovní V 0,5 μl Proudový rozsah 10 pA -1mA Citlivost pg –ng ox./red. látky na elektrodě  3D detekce

Příklad 3D-detekce 27 látek CoulArray ESA,Inc T (min.)

Discovery Zr – High pH + High T HPLC 3 μm a 5 μm částice ZrO2 Zr vázané fáze: Zr-C18 - jako silicaC18 Zr-PBD – polybutadien, jako silicaC18 Zr-PS - polystyren

ZrO2 jako iontoměnič Zr – elektrofil, Lewisova HA  Váže Lewisovy BOH (PO4 3- , F- ,citrát) 2 druhy interakce: ω nebo KD q

Rychlé dělení nesteroidních protizánětlivých léků na Zr-CarbonC18

Monolitické FS - nová éra LC ChromolithTM - monolitický silikagel Struktura: Makropóry – 2 μm, propustné pro FM Mikropóry – 13 nm, plocha adsorpce Výhody: Vysoké průtoky (9ml/min) Rychlost (min) Účinnost (N = 104) Vysoká reprodukovatelnost

Chromolith – rychlost dělení

Testování účinnosti kolon Chromolithu

CIM monolyty Convective Interaction Media IEC, RP, AfC Analytické i preparativní, pro velké biomolekuly CLC – (Conjoint LC) multidimensionální, 4 disky Výhody: Rychlé Vysoké rozlišení Nízký tlak Vysoká reprodukovatelnost Jednoduché zacházení pH 1 - 14 Polymer na bázi methakrylátu nebo polystyrenu

Příklad dělení oligonukleotidů na CIM

Použití HPLC Jediná podmínka - rozpustnost v FM Univerzální – preparativní i analytické Všechny principy LC Jediná podmínka - rozpustnost v FM Výroba léků (inzulin, monoklonální protilátky, Ig) Rutinní analýzy Potravinářský průmysl (obsah vitaminů, pesticidů, transMK) Farmaceutický průmysl (rutinní výstupní kontroly) Klinická biochemie (kontrola metabolizmu, HC) Doping sportovců Ekologie (pitná voda, freony v ledovcích)

Monoklonální protilátky FPLC (Fast Protein, Polypeptide, Polynucleotide LC) Speciální silikagel pro IEC, agarosa pro AfC MAbs Čištění z ascitu Čištění z malého množství bakteriální kultury Monitorování fermentace a produkce Protein A Sepharosa pro FPLC Výhody Protein A Superosy: Vysoce specifické – v jednom kroku požadovaná čistota Snadno se čistí a regenerují

Výroba insulinu Provozní kontrola obsahu proinsulinu v kritických frakcích insulinu pomocí FPLC (Polyanion SI HR5/5)

SPE Solid Phase Extraction Příprava vzorků pro rutinní analýzu, náhrada vytřepávání Pro: HPLC, TLC, GC, ElFo, RIA, spektromerii Princip: Selektivní adsorpce, μl – l, jednorázové Výhody: Rychlé Práce v serii (12, 24, …) Vysoká reprodukovatelnost Levné , malé množství odpadu, ekologické databáze

Postup SPE

Použití Univerzální Farmaceutický průmysl Potravinářský průmysl Klinická biochemie (narkotika v moči, HC, ..)