GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ

Aequorea victoria copyright Claudia .E. Mills 1999

pGLO transformační souprava Genetická transformace Genová regulace Genová selekce DNA RNA Protein Znak

Co je genetická transformace? Příjem cizorodé DNA (často molekula plazmidu) Bakteriální chromozóm Buněčná stěna Plazmid

Co je plazmid? cirkulární molekula DNA schopná se samostatně replikovat výskyt převážně u bakterií nejjednodušší bakteriální vektor (= molekula DNA používaná k inzerci cizorodé DNA do hostitelské buňky) uděluje bakterii nový znak (př. rezistence k ATB)

Inzerce cizorodé DNA do plazmidu gen pro GFP restrikční štěpení DNA přesahující konce DNA ligáza rekombinant plazmid

Plazmid pGLO Beta Laktamáza AraC regulátor Ampicillinová rezistence AraC regulátor Reguluje transkripci GFP Zelený fluorescenční protein GFP Aequorea victoria pGLO ori bla GFP araC

Ampicillin a rezistence Různá antibiotika účinkují na bakterie různě: nejčastěji blokují syntézu buněčné stěny nebo proteosyntézu. Ampicillin inhibuje syntézu peptidoglykanu (polymer buněčné stěny bakterií). β-lactamáza rozkládá laktamový kruh v molekula ampicillinu, a tím ho inaktivuje.

Genová regulace: bakteriální operony Laktózový (Lac) operon

Arabinózový operon DNA vazebný protein: blokuje transkripci Geny důležité pro metabolizmus arabinózy Více o arabinózovém operonu na: http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/Topics/Ara_operon.html

Ara-GFP operon Geny arabinózového operonu byly nahrazeny genem pro GFP K transkripci genu pro GFP dochází pouze v přítomnosti arabinózy

Kdy může GFP ZÁŘIT? pokud je vystaven UV světlu energii vyzáří v podobě zeleného fluorescenčního světla 3-D struktura GFP Více o GFP na: http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm

Jak to funguje v buňce? Bakterie transformované plazmidem pGLO

Metody transformace Molekuly DNA jsou příliš velké na to, aby byly prostou difúzí nebo transportem přeneseny skrz buněčnou membránu Elektroporace Elektrický šok zvýší permeabilitu buněčných membrán pro DNA Teplotní šok Chemicky-kompetentní buňky přijmou DNA po teplotním šoku

Proces transformace: souhrn Resuspendovat bakteriální kolonii v Transformačním roztoku Přidat plazmid pGLO Zkumavku umístit na led Teplotní šok 42oC, umístit zkumavku na led Inkubace se živným médiem LB Vysetí na agarové plotny

Transformace krok po kroku CaCl2 transformační roztok poskytuje ionty Ca++, které neutralizují negativní náboj DNA a fosfolipidů buněčných membrán a umožňují DNA vstoupit do buňky.

Transformace krok po kroku Teplotní šok zvýší permeabilitu buněčné membrány Inkubace v živném médium LB umožní expresi beta laktamázy

Selekce Růst transformovaných bakterií a kontrolních bakterií za různých podmínek. Na jakých plotnách budou růst transformované buňky? Jaké kolonie budou fluorescenčně zářit? LB/Amp LB/Amp/Ara LB

Techniky sterilizace Sterilizace vlhkým vzduchem – autokláv (při teplotě 121°C, čas cca 30 min) Sterilizace suchým vzduchem – v plameni o 160°C a výše, méně účinné Sterilizace UV zářením Sterilizace filtrací (velikost pórů 0,1-0,2 mikrometry) Bakterie a jiné mikroorganizmy jsou všudypřítomné! Sterilní prací předejdete možnosti kontaminace vzorku! Dodržujte bezpečnost práce!

Měření objemů

Děkuji za pozornost