Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie

Obsah 1. Úvod 2. Principy HPLC 3. Instrumentace 4. Úprava vzorku 5. Analýza drog a jejich metabolitů 6. Závěry

1. Úvod GC – obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorky HPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC Výhody – 85 % všech látek lze stanovit (tepelně labilních, polárních, nízko- i vysoko- molekulárních), přímá analýza bez derivatizace – časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků Ve spojení s citlivou detekcí – MS – možnost identifikace a kvantifikace Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší účinnost než GC, vyšší finanční náklady na analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)

2. Principy HPLC Mobilní fáze: kapalina složení mobilní fáze ovlivňuje separaci Stacionární fáze: chemicky vázané fáze adsorbenty měniče iontů gely (pro SEC) afinitní fáze Vysoká účinnost a rychlost analýzy – vysoké tlaky a malé částice s jednotnou velikostí, homogenně naplněné v koloně

Chromatogram (kvalita, kvantita, účinnost separace) t R – retenční čas, t´ R – redukovaný čas, plocha nebo výška píku, w – šířka píku

Závislost H na lineární průtokové rychlosti mobilní fáze u H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n n (počet pater) = 16(t R /w) 2

Závislost H na velikosti částic Čím účinnost separace 2  m 3  m 5  m 8  m

Volba kolony Náplně: zcela porézní částice  m, velikost pórů 10 – 50 nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně naplněné v koloně pelikulární – polopropustné (nepropustné jádro, tenká pórovitá vrstva nepórovité – rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 – 0,4 nm nedostupné pro solut monolitické kolony, vtištěné polymery Specifický povrch  zátěž (dávkování) póry 10 nm  170 m 2 30 nm  100 m 2 nepórovité  0,6 – 6 m 2 /g

Miniaturizace (  HPLC) Zmenšování velikosti částic a průměru kolony Výhody: snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární fáze a vzorku vyšší účinnost separace vyšší citlivost detekce kompatibilita s MS detekcí Průměr kolonyPrůtok 4,5 mm1 mL/min 1 mm0,047 mL/min 0,25 mm0,003 mL/min

Chemicky vázané fáze Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými funkčními skupinami: alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl – nepolární (reverzní) fáze – nejvýznamnější (RPLC) normální fáze – polární – méně používané iontově výměnné skupiny -SO 3 H, - COOH, -NH 2, -N + (R) 3 chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)

Struktura chemicky vázaných fází

Mobilní fáze Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky neomezené Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty, kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita, těkavost reverzní fáze – voda + organická rozpouštědla (pufry, pH, iontově párová činidla…) retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla nepolární fáze – nepolární organické rozpouštědlo + polární modifikátor (<1 %) měniče iontů – pufry Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování teploty v GC)

Derivatizace Derivatizací měníme fyzikální a chemické vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení analytů na deriváty jsou tyto: zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v kombinaci s fluorescenčním detektorem) zvýšení těkavosti (v GC) zlepšení chromatografických vlastností (např. změna polarity), zlepšení stability analytů, umožnění chirální separace, změna matrice pro lepší separaci.

Kvalitativní analýza k = (t R – t M ) /t M (retenční poměr) r 12 =  12 = t´ R2 /t´ R1 = k 2 /k 1 (relativní retence, selektivita) Reprodukovatelnost: složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava stacionární fáze

Kvantitativní analýza Zdroje chyb: Odběr reprezentativního vzorku Úprava vzorku (nejvýznamnější) Dávkování (1-2 %) Stacionární fáze Instrumentace, zpracování signálu a interpretace

Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů Vnitřní normalizace: xi = (A i /  A j )  100 Absolutní kalibrace mi = (A i /A s ) m s Vnitřní standardizace mi = (RMR sr /RMR ir ) (A i /A s ) (V s / V i ) m s Metoda standardního přídavku A – plocha m – množství V i, V s – objemy při ředění v i,v s – dávkované objemy vzorku a stand. RMR – relativní mol. odezva

3. Instrumentace Blokové schéma chromatografu 1 - zdroj mobilní fáze, 2 – čerpadlo, 3 – dávkovač, 4 - kolona, 5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru

Zásobník m.f. – uzavřená nádoba, odplynit čerpadla – bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od  l/min po mL/min dávkovače – smyčkové (vzorky v  l) automatické dávkovače kolony – preparativní či analytické, náplňové i kapilární, vnitřní průměr od desítek  m po jednotky mm, nerezové či skleněné detektory – spektrofotometrický (diode-array) refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční, hmotnostní vyhodnocovací zařízení

Čerpadlo reciprokační

Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony 1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 - připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4

Kolony: náplňové  3 – 5 mm, ~ 1 mL/min mikronáplňové ~ 1 mm, ~  L/min kapilární ~ 10  m, ~ nl/min Materiály: silikagel (pH 2-8, endcapping) alumina (pro bazické látky) organické polymery Monolitické kolony Vtištěné polymery

Monolitické kolony až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca 70 % u náplňových kolon) vyšší účinnost separace velká porozita  vysoký průtok, rychlé analýzy makropóry –  2  m  velký průtok, malý tlakový spád mesopóry – 13 nm  velký povrch pro sorpci analytů na bázi silikagelu nebo organických polymerů

Detektory UV/VIS – nejběžnější, s diodovým polem (DAD), téměř univerzální fluorescenční – citlivý, selektivní, derivatizace elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené použití hmotnostní – nejvyšší vypovídací schopnost (kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita

UV/VIS detektor (a) schéma, (b) uspořádání mřížky

Schéma fluorescenčního detektoru 1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované záření, 5 ‑ vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5  l), 8 - držák

Blokové schéma hmotnostního spektrometru

Iontový zdroj - převedení analytu do ionizovaného stavu, fragmentace. Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji. Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do hmotnostních spekter. Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých tlaků - výkonný vakuový čerpací systém. Vstup umožňující převedení vzorku do iontového zdroje. GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní (interface) snižující podíl mobilní fáze

Iontové zdroje Ionizační energie 7-16 eV Výtěžek ionizace kolem 0,01% Ionizační techniky měkké (nízká fragmentace) a tvrdé (vysoká fragmentace) GC Ionizace elektronem (electron ionization, EI) Chemická ionizace (chemical ionization, CI) HPLC Sprejové ionizační techniky v kapalné fázi, měkké termosprejová ionizace (thermospray, TS) elektrosprejová ionizace (electrospray, ES) chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure chemical ionization, APCI )

Schéma iontového zdroje ES

Schéma iontového zdroje APCI

Analyzátory Magnetický hmotnostní analyzátor Kvadrupólový analyzátor Iontová past (ion-trap) Průletový analyzátor (time of flight, TOF)

Interface Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving belt interface) sprejové ionizace – většina těkavých látek odvedena mimo MS – bez interface mikroHPLC - přímý vstup MS/MS-LC systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty

Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou smyčkou

Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem

Požadavky na HPLC-MS systém Kolona – malý průměr, malé průtokové rychlosti  přímý převod do MS (bez interface) Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek ionizace

4. Úprava vzorku – přečištění, zakoncentrování Kapalné vzorky (moč, serum, sliny): extrakce kapalinou (LLE) extrakce tuhou fází (SPE) – nejběžnější materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze, vtištěné polymery, atd. mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME) Tuhé vzorky (tkáně, vlasy): Soxhlet zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE) extrakce ultrazvukem extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)

SPME Solid phase micro- extraction

a-SPME extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v HPLC

Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC a) extrakce

b) Desorpce

Příprava vtištěných polymerů

5. Analýza drog a jejich metabolitů Analýza tělních tekutin Analýza krve - deproteinizace extrakce rozpouštědly (LLE) extrakce tuhou fází (SPE, SPME) přečištění extraktu na měničích iontů zakoncentrování odpařením vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS

Analýza vlasů Odběr vzorku – velká variabilita (místo odběru, stáří, pohlaví) - 10 – 250 mg vzorku dekontaminace vlasů (kosmetické přípravky, prach a pod.) extrakce, přečištění extraktu, zakoncentrování vlastní analýza

(A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkované amobarbitalem (B) hmotnostní spektrum této látky

Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace významných nox Podmínky analýzy Gradientová eluce metanolem s 0,1% HCOOH Monolitická kolona Chromolith Detekce ESI-MS Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně ionizovány pozitivní ESI Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml (K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) 93–102)

( I) amfetamin, (II) 3,4-MDMA, (III) buprenorfin, (IV) clenbuterol, (V) salbutamol, (VI) LSD, (VII) metandienon, (VIII) nandrolon, (IX) stanozolol, (X) testosteron, (XI) morfin, (XII) f enobarbital, (XIII) psilocybin, (XIV) temazepam

MS–MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA

A p-OH-AP, B p-OH-MA, C norefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4- methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA), H MA, I methoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)

(1) psilocybin (2) morfin (3) salbutamol (4) amfetamin (5) 3,4-MDMA (6) clenbuterol (7) LSD (8) fenobarbital (9) buprenorfin (10) temazepam (11) nandrolon, (12) metandienon (13) testosteron (14) stanozolol Rekonstruovaný iontový chromatogram

Analýza amfetaminů Mikroextrakce monolitickou kapilárou on-line s HPLC (UV detekce) pro analýzu amfetaminu, methamfetaminu a jejich methylendioxy- derivátů v moči D.L. 1.4–4.0 ng/mL. Vysoká reprodukovatelnost (RSD < 2.9%) v rozsahu 0.05–5 g/mL, doba analýzy  25 min. (Yi F. et al., J.Chromatogr.A, 1074 (2005) 9–16.)

Amfetamin (PA), methamfetamin (MPA), 3,4-methylendioxo- amfetamin (MDA), 3,4-methylendioxomethamfetamin (MDMA)

Analýza vzorku s PA,MDA,MPA, MDMA (1  g/mL) s SPME (a) a přímý nástřik (b)

Analýza moči 3 osob podezřelých ze závislosti na amfetaminech

Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího DMA 4 – MA 5 – AP 6 – DMA-N-oxid 7 –DMA

Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího selegilin 1 - SG-N-oxid 2 – desmethylselegilin 3 – ethylamfetamin 4 – MA 5 - AP

Struktura Fen, Norf a N-Fen N-Fen v čínských přípravcích k hubnutí – Fen a Norf- metabolity, škodlivé účinky, zakázané

A – extrakt vlasů, B – extrakt vlasů se 100 pg/mg norfenfluraminu a 230 pg/mg fenfluraminu, C - extrakt 1 vlasu pacienta (HPLC s fluorescenční detekcí po derivatizaci)

Stanovení meprobamatu ve vlasech Předběžná úprava: 1 M HCl přes noc při 60 o C Extrakce: LL s fosfátovým pufrem (pH 5,5) a chloroformem Analytická metoda: HPLC-MS nebo GC-MS pro derivatizaci s trimethylfenylamonium hydroxide Měřené koncentrace 3,32 and 4,21 ng/mg (2 osoby) DL 0,2 ng/mg [28] Dávka: 400 mg 4,27–6,08 ng/mg. 800 mg 8,54–13,01 ng/mg 1200 mg 11,89–17,64 ng/mg

Sulfonylmočovinové antidiabetikum glibenclamid

Extrahovaný iontový chromatogram m/z 221, celkový iontový chromatogram a hmotnostní spektrum ethylglukuronidu (metabolit ethanolu)

Tetrodoxin - toxin z ryby ježíka

Stanovení halucinogeních aminů Psilocybin (4-fosforyloxy-N-dimethyltryptamin) Psilocin (4-hydroxy-N,N-dimethyltryptamin) HPLC s elektrochemickou detekcí, + 1,0 V (Ag/AgCl), mobilní fáze 0,1 M fosfátový pufr, pH 3, v/v ethanolu Obsah v houbě Psilocybe bohemica Šebek Psilocybin0,57 % Psilocin 0,061 %

HPLC analýza extraktu houby Psilocybe bohemica Šebek s UV a elektrochemickou detekcí (R.Kysilka a spol., J.Chromatogr. 320, 414 (1985))

Antiepileptika – HPLC-MS (API-ES positive) kafein, fenylethylmalonamid,ethosuximid, primidon, fenobarbital, methylfenylsukcimid, karbamazepinepoxid, fenoytoin,karbamazepin )

HPLC-UV analýza Ginko biloby (SPE –C18, gradientová eluce methanol-H 3 PO 4 -voda

HPLC-DAD analýza extraktu rostliny Ephedra Sinica Stamp ( extrakce etherem, gradientová eluce acetonitril, H 3 PO 4,voda)

Chirální separace Důležité ve farmaceutickém průmyslu, ale i při stanvoení metabolitů Derivatizace s chirálním činidlem v kombinaci s nechirální stacionární fází Chirální stacionární fáze – chemicky vázaný cyklodextrin, ergotalkaloidy, albumin atd.

Extase (ADAM, E, XTC) MDMA – 3,4-methylendioxymethamfetamin 1912 – vyvinuto firmou Merck jako anoretikum, neuvedeno na trh euforické a stimulující účinky enantimery, S + forma je potentnější než R - forma chirální separace s chemicky vázanou fází (cyklodextrin)

Extrahovaný chromatogram (A) moči a MS spektra L-AP (B) a L-MA (C) 1, D-AP; 2, L-AP; 3, D-MA, 4 L-MA

Závěry HPLC-MS stává rutinní metodou v analytické toxikologie Umožňuje identifikaci a stanovení drog a jejich metabolitů ve stopových koncentrací ve složité matrici Miniaturizace usnadňuje spojení HLPC-MS Nové stacionární fáze: zrychlení analýzy, vyšší selektivita

Doporučená literatura V. Pacáková, K. Štulík, Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SNTL, Praha K.Štulík a kol., Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004