DĚLICÍ METODY I. – úvod Význam DM– výskyt studovaných látek ve směsích Podmínka studia: Získat čistou látku Ověřit její čistotu

Historie DM Alchymisté: destilace, srážení, extrakce, krystalizace 20.století: LSC - chemie přírodních látek PC, IEC – chemie bílkovin AC – jednostupňová operace → antigeny Empirie → racionální přístup

Klasifikace DM Podmínka dělení: rozdíl aspoň v jedné fyzikální či chemické vlastnosti Podle vlastností b.v.- destilace, lyofilizace Rozpustnost – krystalizace, srážení, extrakce KD – extrakce, LLC,GLC KHA, KBOH – IEC μ – Elfo V – centrifugace, GPC, dialýza, UF Podle fází V jedné fázi – Elfo, dialýza Mezi dvěma fázemi – chromatografie, krystalizace, destilace

Organická chemie individuum Volba DM Šetrnost x účinnost x ekonomika Dělení není ani teoreticky 100% ← K Hodnocení dělení: Stupeň čistoty Výtěžek [%] IZOLACE (vydělení) SEPARACE (oddělení) Organická chemie individuum Biochemie skupina látek DĚLICÍ METODY

Typicky vícestupňový postup čištění proteinu Stupeň Celkový protein Objem Celková aktivita Specifická aktivita Výtěžek Stupeň vyčištění mg ml U U/mg % 1. Hrubý extrakt 19 200 372 192 0,01 100 1 2. Precipitace síranem amonným 5 400 74 120 0,02 62 2 3. Chromatografie na DEAE-celulose 340 103 0,29 52 29 4. Chromatografie na hydroxyapatitu 50 20 80 1,6 41 160 5.Gelová filtrace na Sephadexu G-100 6 60 10,0 30 1000

1. NALEZENÍ ZDROJE Ekonomické hledisko: Co nejlevnější zdroj Co největší obsah

2. UVOLNĚNÍ Z TKÁNĚ desintegrace, destrukce MECHANICKY – mlýny, kuchyňský masový mlýnek HOMOGENIZACE – s pufrem, mixer LYSE BUNĚK OSMOTICKÝM TLAKEM CHEMICKY – louh, enzymy: lysozym, celulasa, RŮZNÉ – ultrazvuk „acetonový prášek“ Homogenizátor Pottera a Elvehjema

Metody desintegrace buněk

3. EXTRAKCE l, s  l () ll Teorie extrakce → výpočet výtěžku → LC – mnohonásobná kontinuální extrakce Volba rozpouštědla: Maximální cA SIMILIA SIMILIBUS SOLVENTUR ll Minimální vzájemná rozpustnost kapalin – eluotropická řada εr , maximální Δεr Maximální D Maximální Δρ (ne emulze), minimální η, inertnost

3.1. EXTRAKCE Z KAPALINY KD= (aA)org./(aA)H2O D = (cA)org./(cA)H2O Rozdělovací konstanta Rozdělovací koeficient KD= (aA)org./(aA)H2O D = (cA)org./(cA)H2O E (výtěžek %) ≈ D, Vorg./VH2O, n

3.1.1 METODY Vytřepávání – dělička (3x) Roztřepávání, protiproudé rozdělování

Protiproudé rozdělování - Craigování Průmyslové použití Rychlé, Bezodpadové Malá spotřeba rozpouštědel Matematické zpracování ↓ optimalizace procesu antibiotika, cholesterol z lanolinu

Izolace surového methyloxytocinu (SPOFA) Přístroj: QUICKFIT & QUARTZ 100 jednotek 0,05% AcOH v sec.BuOH

Soxhletův extraktor za horka kontinuální 3.2. EXTRAKCE Z PEVNÉ LÁTKY Soxhletův extraktor za horka kontinuální

Moderní Soxhlet SOXTEC Tecator – nepřímé vyhřívání cirkulujícím olejem ROVNOVÁŽNÝ EXTRAKTOR Tecator – mechanicky pro tepelně a světelně citlivé látky SOXWAVE Prolabo Fokusovaná mikrovlnná technologie Automatické Úspora času,rozpouštědel, nákladů Šetrné SOXTEC

4. SRÁŽENÍ s c 4.1.1 VYSOLOVÁNÍ Rozpustnost cystinu x I – iontová síla IEB (NH4)2SO4, Na2SO4, Na3PO4 vsolování vysolování

Použití vysolování (NH4)2SO4 Výhody Vysoká x , nezávislá na T Malý denaturační vliv Vysoká dělící schopnost frakční vysolování laciné Použití NK (30% (NH4)2SO4) BÍLKOVINY (30 – 75%) př. penicilinasa (60l →2,4kg, 4x specifická aktivita) Mastné kyseliny Sulfonové kyseliny

4.1.2 SRÁŽENÍ ORG. KAPALINOU Vytěsnění organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou Zmenšení solvatačního obalu Aceton, EtOH, MeOH, py, pro bílkoviny polyethylenglykol

4.2. SRÁŽENÍ ZMĚNOU pH Bílkoviny  IEB (kasein z mléka) Adenin  Ade2S + NaOH

4.3. TVORBOU NEROZPUSTNÝCH KOMPLEXŮ NK (PO4-) + SEPTONEX streptomycin sulfát Denaturace těžkými kovy – Hg2+, Pb2+, Cd2+ 4.4. TEPELNÉ SRÁŽENÍ Pro termostabilní enzymy – př. kvasničná ADH