Průtoková cytometrie a její využití v rostlinné biosystematice, populační biologii a fyziologii rostlin J. Suda1,2, P. Trávníček2,1 1 Department of Botany, Faculty of Science, Charles University in Prague & 2 Institute of Botany, Academy of Sciences, Průhonice, Czech Republic

Principy FCM Průtoková komůrka Optická část Základní předpoklady: Zdroj nejlépe monochromatického světla (laser, HBO lampa) Fluorescenčně značené partikule či chemické látky Znalost použitého fluorescenčního barviva (excitační a emisní maximum) Hardware a software schopný zpracovat výstupní signály 1 z 26

Principy FCM - třídění Zjištění parametrů konkrétní částice Vytvoření mikrokapiček pomocí piezoelektrického krystalu Nabití mikrokapiček nábojem dle vlastností obsažené partikule Vlastní třídění částic dle náboje 2 z 26

FCM v rostlinné biosystematice Základní východiska: nejčastěji analyzován celkový obsah DNA (ploidní úroveň, velikost genomu) využití fluorescenčních barviv s vazbou na DNA (DAPI – A-T specifická vazba, PI – interkalace) většinou jednoparametrická analýza (počet částic s určitou intenzitou fluorescence) velmi jednoduché cytometry a levné provozní náklady 3 z 26

Aplikace – taxonomie na základě ploidie Empetrum 2x - E. nigrum 4x - E. hermaphroditum Anthoxanthum 2x - A. alpinum 4x - A. odoratum Oxycoccus 2x - O. microcarpus 4x-6x - O. palustris Relative fluorescence Number of nuclei 160 320 480 640 800 250 500 750 1000 2x 4x Relative fluorescence Number of nuclei 4 z 26

Aplikace – vzácné cytotypy Vaccinium - 3x Lythrum - 3x, 6x Campanula patula - 8x 5 z 26

Aplikace – heteroploidní křížení Oxycoccus - 5x Empetrum - 3x Galeobdolon - 3x 6 z 26

Aplikace – taxonomie homoploidů H. schultesii 2C=7.21 pg G2 H. aurantiacum 2C=7.80 pg Hieracium subg. Pilosella Reynoutria Determinace fragmentů rostlin, kořenů, … 7 z 26

Aplikace – homoploidní křížení Elytrigia repens x E. intermedia 2n = 42 Dryopteris carthusiana x D. dilatata 2n = 164 8 z 26

Aplikace – vnitrodruhová variabilita Taraxacum stenocephalum (2n = 32) 9 z 26

Aplikace – dedukování příbuznosti „základní druhy“ „vedlejší druhy“ 2.05 1.98 1.97 1.88 1.73 1.81 1.95 2.02 2.03 2.14 Cx-values for 4x cytotypes Hieracium subg. Pilosella 10 z 26

Aplikace – distribuce cytotypů Vaccinium uliginosum Empetrum 2x 4x 3x 11 z 26

Aplikace – distribuce cytotypů 4x 2x 3x Empetrum Krkonoše 2x 2x + 3x 3x 4x * 100 m Mumlavská hora Jeřábí louka 12 z 26

Aplikace – sympatrický výskyt Pimpinella saxifraga 2x + 4x  dynamika populací a demografické parametry  mechanismy reprodukční izolace  mezi a vnitro cytotypové interakce  ekologické a funkční aspekty polyploidie Gymnadenia 4x + 6x + 8x + 10x +12x Vicia cracca 2x + 4x Galeobdolon 2x + 3x + 4x Hieracium echioides 2x + 3x + 4x + 5x Oxycoccus 2x + 4x + 5x + 6x Campanula patula 2x + 4x 13 z 26

Aplikace – rostlinné invaze Vaccinium - 3x 2x 3x 4x 6x Lythrum salicaria Reynoutria 14 z 26

Aplikace – ochrana rostlin Cerastium alsinifolium detekce míry introgrese Gymnadenia conopsea diverzita cytotypů 4x 8x 6x, 10x, 12x 15 z 26

Aplikace – návaznost na jiné obory Juncus biglumis - fylogeneze 2C = 1.48 pg 2C = 1.39 pg 16 z 26

Determinace pohlaví Arecaceae Cannabaceae Caryophyllaceae Cucurbitaceae Loranthaceae Polygonaceae Silene latifolia 2n = 24 F – XX, M – XY 17 z 26

Analýza buněčného cyklu a) Kinetika BrdU – bromodeoxyuridine Kořenový meristém Vicia faba b) Synchronizace Zastavení buněčného cyklu v konkrétní fázi působením rozličných chemických látek Např. akumulace metafazických buněk pro třídění chromozómů 18 z 26

Brassica oleracea – různé stupně endopolyploidizace pletiv Endopolyploidie Brassica oleracea – různé stupně endopolyploidizace pletiv 19 z 26

Endopolyploidie u orchidejí Gymnadenia densiflora G. conopsea (2n = 40) G. conopsea (2n = 80) Taxon 2C – ~4C ~4C – ~8C Gymnadenia densiflora 1.794 1.864 G. conopsea (2n = 40) 1.565 1.730 G. conopsea (2n = 80) 1.610 1.765 20 z 26

Reprodukční způsoby 21 z 26

Reprodukční způsoby Taraxacum Hypericum sexuální apomiktické velká variabilita Hypericum 22 z 26

Reprodukční způsoby Experimentální hybridizace: 6x fakultativní apomikt (♀) x 4x obligátní apomikt (♂) semenáčky semena Ploidie potomstva: 6x (apomixie) 3x (haploidní partenogeneze) 5x (redukovaná gameta) 7x (redukovaná + nered. gameta) 8x (neredukovaná + red. gameta) 23 z 26

Metodika – herbářový materiál Po 1. roce Po 2 letech čerstvý materiál Po 1. roce Oxycoccus 24 z 26

Metodika – herbářový materiál 36 měsíců – pokojová teplota 2x 4x 5x 6x 36 měsíců – -80°C (deep freezer) 2x 6x 5x 4x 25 z 26

Metodika – herbářový materiál Závěry:  rychlé sušení  uchování v – 80°C (deep freezer) čerstvý materiál 36-měsíců starý, DF 26 z 26

Děkuji za pozornost www.ibot.cas.cz/fcm