VIRY A 26S PROTEAZOM: cesta k destrukci Zuzana Kauerová 2004/2005

1. Když se řekne proteazom Velké membránové multipodjednotkové komplexy, obsahující proteázy Hlavní úkol: degradace intracelulárních proteinů Výskyt: jádro a cytoplazma u eukaryotních buněk

1.1 Hlavní funkce Odstraňují abnormální proteiny z buňky Podílejí se na reakcích na stresové situace degradací proteinů, označených ubikvitinem (Ub) Jako součást Ub systému se zapojují do regulace buněčných procesů Kontrolují diferenciaci buněk (degradují transkripční faktory a metabolické enzymy) Velkou roli hrají v imunitním systému, kde vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy

1.2 Proteinová degradace Nově objevený mechanizmus buněčné regulace Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost, umožňující buňce rapidní redukci hladiny určitých proteinů Nevratný děj – kompletní ztráta funkcí Základní požadavek: vysoká specifita

1.3 Ubikvitinace Nejobecnější způsob označování proteinů k degradaci v proteazomech Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách Katalýza: - E1 aktivující enzymy - E2 konjugační enzymy - E3 vazebné enzymy (pouze v některých případech)

Proces degradace s ubikvitinem: Ubikvitin je aktivován vytvořením thiosterové vazby s aktivačním enzymem E1. Ubikvitin je pak přenesen do aktivní cysteinové skupiny konjugačního enzymu E2, který ubikvitin naváže na aminoskupinu zbytku lyzinu substrátového proteinu. Pro tento proces je v některých případech nutná kooperace s enzymem E3. Opakovaná konjugace ubikvitinu s lyzinovými zbytky vede ke vzniku multiubikvitinových řetězců, které, navázané na substrátový protein, jsou rozeznány a degradovány v proteazomech. Multiubikvitinový řetězec se uvolní z komplexu a ubikvitin je recyklován.

1.4 Struktura proteazomu 2 části: 20S proteazom jádrem větší částice 26S proteazomu Oba komplexy existují v dynamické rovnováze Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje ubikvitinované proteiny, 20S proteazom ne => 26S proteazom využívá ATP Přídavná část – 19S víčka - slouží k zachycení a přitáhnutí označeného proteinu do proteazomu

1.5 Funkce 26S proteazomu Plní životně důležité funkce: kontrola buněčného cyklu buněčná diferenciace regulace metabolických drah role ve stresových situacích odstraňování abnormálních proteinů

Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu

2. Proteazom a viry Ke konci 90. let bylo objeveno, že onkoprotein E3 lidského papillomaviru vede k proteazomové destrukci proteinu p53, který tlumí tvorbu a vývoj nádoru O desetiletí později se ukázalo, že zmnožení virových proteinů je určující pro proteolytickou degradaci proteinů hostitelské buňky Tyto aktivity jsou nutné pro mnoho různých aspektů životního cyklu virů od vstupu do buňky, přes replikaci a zmnožení, až po opuštění buňky virem

2.1 Vstup viru do buňky Vstup viru do buňky – různé překážky, např. imunitní dohled, zablokování buněčného cyklu v důsledku virové replikace, sebevražedná apoptická smrt buňky Jedna ze společných překážek – obrovská stechiometrická nerovnováha cílových proteinů hostitele => mnoho virů vyvinulo mechanizmy, pomocí nichž jsou buněčné cílové proteiny směřovány do 26S proteazomu a vystaveny proteolytické degradaci

2.2 Označení cílových proteinů Vysoce specifický proces Nejčastěji využití E3 ubikvitin ligázy - může být kódována přímo virem nebo může být ligázou hostitelské buňky, která byla přesměrována do substrátu Tak mohou být rozpoznány substráty, které by za normálních okolností nebyly rozeznány

Degradace proteinu označeného ubikvitinem a společné body vstupu viru do buňky • Ve většině případů virus zasahuje v kroku E3 ubikvitin ligázy. Ta může být kódována virem nebo může být buněčnou ligázou, která je buď přesměrována, nebo stimulována jiným virovým proteinem. Intenzivně ubukvitinovaný cílový protein je pak degradován v proteazomu.

Příklady využití ubikvitin ligáz Lidský papillomavirus (HPV) – obsahuje E6 protein, který stimuluje ubikvitinizaci a degradaci buněčného proteinu, potlačujícího nádorové bujení = protein p53 virus stomatitidy, virus vztekliny – interakce jejich matrix proteinů s buněčnou ubikvitin ligázou Nedd4 (při opuštění buňky virem) – neznámý mechanizmus virus Epstein-Barrové - virový membránový protein 2a přesměruje aktivitu Nedd4 => označení B-buněčných tyrozin kináz k degradaci v proteazomu => změna signalizace B-buněčných receptorů => vznik latentní virové infekce

3. Modelové situace 3.A HPV vs protein ICP0 Herpes virus simplex (HSV-1) => protein ICP0 - jeden z prvních virových proteinů, který se projevuje při reaktivaci z latence Aktivita ICP0 je závislá na své lokalizaci v jaderné struktuře, známé jako ND10 Přítomnost ICP0 vede k degradaci dvou hlavních ND10 komponent - antigenu promyelocytické leukémie (PML) a Sp100 - a tím k rozpadu ND10 (někdy pod názvem POD)

Nutný aspekt pro funkci ICP0 proteinu – RING-fingers (Really Interesting Gene) na N-terminálním konci RING-fingers usnadňují transfer ubikvitinu (nebo molekul jemu podobných) z E2 enzymu na heterologní substráty Proteiny obsahující RING-fingers vytváří největší známé třídy E3 ligáz a objevují se v mnoha buněčných procesech

Ztráta funkcí RING-prstů - devastující efekt na většinu aktivit proteinu Přesto zůstává zachována C-terminální část, která obsahuje jaderný lokalizační signál (NLS) a vazebnou stranu pro ubikvitin specifickou proteázu USP7 USP7 se zapojuje do deubikvitinace a stabilizace p53 => oddělení tohoto proteinu od ICP0 může být důvod změny aktivity p53 Mj. cílovými proteiny ICP0 jsou katalytické podjednotky DNA-PK a dva proteiny centromer CENP-A a CENP-C

ICP0 může také vázat a stabilizovat cyklin D3 a přemísťovat ho do ND10 To způsobuje tvorbu aktivního komplexu cyklinu D3 a cyklické dependentní kinázy 4 (cdk4), který fosforyluje pRb supresor tumoru => podpora progrese G1 fáze Jedna z funkcí tohoto komplexu je podporovat ubikvitinaci a degradaci cyklinu D1 D cykliny jsou normálně uplatněny v podpoře přechodu buněčného cyklu přes G1 až S fáze, takže další vysoké hladiny těchto proteinů by pravděpodobně držely hostitelskou buňku ve stavu replikační pohotovosti, což je ideální prostředí pro replikaci geonomu viru

Shrnutí modelu (HPS)-1 vs ICP0 ICP0 tedy interaguje s 26S proteazomem dvěma způsoby: RING-prsty se uplatňují jako E3, což vede k degradaci komponent ND10 a centromer, a tím k napomáhání virové transkripci Doména C-terminálního konce působí jako pseudo-E3, kompetitivně inhibující proteazomální degradaci cyklinu D1, což podporuje buněčné prostředí, které je prospěšné virové replikaci DNA

• Infekce virem Herpes simplex (HSV-1) - buněčný protein ICP0 navozuje degradaci PML a Sp100, zprostředkovanou interakcí E2 enzymu (UbcH5a/H6) s RING sekvencí • C-terminální polovina ICP0 také interaguje s další součástí enzymu E2 cdc34, která je obsažena v D1 cyklinu • ICP0 stabilizuje D cykliny, díky čemuž se může chovat jako pseudo-E3 enzym

3.B Adenovirus vs E4-orf6-E1B55k-cullin komplex V buňce infikované a transformované adenovirem je hladina p53 snížena Důvodem - asociace virových proteinů E155K a E4orf6 proteinu s p53 E155K a E4orf6 se vážou na p53 svými N a C konci, a naopak, cože vede k proteazom dependentní redukci délky života proteinu p53 na polovinu

Systém využívá von Hippel-Lindau (VHL) tumor-supresorového komplexu Jeho součástí - Elongin BC, na který se váže E4orf6 protein, a rodina látek zvané culliny a Rbx1 Celý komplex = E2 ubikvitin ligáza, která je posilována E1B55K s cílem degradace p53 zprostředkované proteazomem

• Ubikvitin ligázový komplex E1B55K-E4orf6-cullin navozuje degradaci p53 tumor-supresorového proteinu • E1B55K a E4orf6 se oba přímo vážou na p53

4. Závěr Užití proteazomu různými virovými proteiny zdůrazňuje centrální důležitost buněčných cest pro mnoho úspěšných virových infekcí. Za normálních podmínek by tumor-supresorový protein p53 zastavil abnormální proliferaci buněk a/nebo navodil apoptózu, přesto v některých situacích dochází k transformacím a malignitám. Hlavními cíly je prozkoumat a využít degradační strategie virů v terapii rakoviny a antivirové terapii celkově.