Projekt ľudského genómu Prehistória História Ciele Metódy Priebeh Výsledky Využitie Perspektívy -------------------- základná www stránka: www.doegenomes.org

Prehistória: Watson a Crick 1953

Genetika človeka v r. 1953 hodnotenie rodokmeňov štúdium dvojčiat cca 50 monogénnych ochorení 5 monogénnych znakov (ABO, Rh...) 48 chromozómov ! 5 miliónov génov ! žiadna DNA (podľa učebníc) !

60-te roky: cytogenetika človeka 1956: 46 chromozómov 1959: chromozómové aberácie a choroby 1960: nomenklatúra a metodika chromozómy a nádory chromozómy: „orgán“ lekárskej genetiky ľudských génov jeden milión, o DNA stále ani zmienka...

70-te roky: žeby DNA? polymorfizmy (sérové skupiny, izoenzýmy...) väzba a chrom. lokalizácia bunkové hybridy biochemická genetika Ale už aj: prvé RFLP v ľudskej DNA (1978) DNA diagnostika chorôb (1979) 100 000 génov

Human Genome Project: história 1984: Alta Utah USA: vznik idei oskevenovať ľ. g. 1986: Santa Fe - DoE Intl. Meeting záver: projekt je uskutočniteľný a bude znamenať veľký pokrok v biológii 1988: vznik Úradu pre výskum ľudského genómu Kongres USA schválil 15 ročný projekt a dotáciu 3 mld USD 1989: založenie HUGO (The Human Genome Org.) cieľ: koordinácia HGP projektov na celom svete 3 centrá: - Bethesda pre USA - Londýn pre Európu - Tokyo pre oblasť Pacifiku 1990: začiatok projektu 2005: predpokladané ukončenie

HGP: rozsah 3 200 x 106 bp (dĺžka Dunaja v mm !) dovtedy najdlhší sekvenovaný úsek: ľudská mtDNA (16 500 bp, 1981) vtedajšia rýchlosť: 100 bp / osoba / deň cena: 5 - 10 USD/bp Oficiálny začiatok HGP: 1990 20 pracovísk zo 6 štátov 3 mld USD cca 15 rokov práce (t.j. do r. 2005)

História sekvenovania DNA bp/osoba/rok rok udalosť 1 1965 Holley sekv. alanyl tRNA S. cerev. 15 1970 Wu sekvenoval 12 bp lambda fága 150 1 500 1977 1978 Sanger dideoxy, Gilbert chem. sekv. Sanger sekv. phi-x174 (5375 bp) 15 000 1980 Messing vyvinul M13 vektor 25 000 1986 Hood – čiastočne automat. sekv. 1,000 000 1995 Venter – autom. fluoresc. sekv. 150, 000 000 1999 Perkin-Elmer 96 kapilárny sekv. ? 000, 000 000 2004 každý kto má vybavenie

HGP: ciele Triangulovať genóm pomocou DNA markerov Identifikovať a mapovať gény, určiť ich štruktúru a funkciu v zdraví aj v patológii Identifikovať dôležité mimogénové sekvencie Určiť úplnú sekvenciu genómu (3,2 Gb) Všetky dáta uložiť vo verejne prístupných databázach 1996: Bermudská dohoda Sekvenovať genómy modelových organizmov (drozofila, myš, C. elegans, A. thaliana a i.) Skúmať etické, legálne a sociálne aspekty

HGP: navrhovaný postup Konštrukcia genetickej mapy s vysokým rozlišovaním Konštrukca rôznych typov fyzických máp všetkých chromozómov Vývoj vhodných laboratórnych technológií Vývoj hardware a software na spracovanie získaných údajov Kompletizácia, analýza a anotácia sekvencie ľudskej DNA

Metódy mapovania Genetické mapy pomocou DNA polymorfizmov slúžia ako triangulačné body pri mapovaní génov sú nevyhnutným predpokladom klonovania génov slúžia ako rámec na konštrukciu fyzických máp 1987 – prvá genetická mapa človeka 403 polymorfizmov väčšinou typu RFLP 1992 – genetická mapa založená na STR významný prelom (813 markerov) 1994 – integračná mapa 5800 markerov, denzita 0,7 cM

Metódy mapovania – pokr. Fyzické mapy sú rôzne typy s rozdielnou rozlišovacou schopnosťou cytogenetické mapy: rôzne typy prúžkovania chromozómov (G-, R-prúžk.) rozlišovacia schopnosť niekoľko Mb radiačné hybridné mapy: fragmentácia chromozómov ožiarním vytvorenie hybridných chromozómov fúziou s inými typmi buniek (myš, potkan) rozlišovacia schopnosť cca 0,5 Mb kontigové mapy prekrývajúcich sa klonov YAC klony – rozlišovanie niekoľko 100 kb BAC klony – rozlišovanie do 300 kb kozmidové klony – rozlišovanie cca 40 kb

Metódy mapovania – pokr. STS mapy – Sequence Tagged Site vyžadujú informáciu o sekvenčnom zložení zoradených klonov metóda detekcie: PCR rozlíšenie cca 100 kb EST mapy – Exprimed Sequence Tag sú to vlastne STS mapy pre kódujúcu DNA príprava: sekvenovanie cDNA a ich spätné zmapovanie do fyzických máp rozlíšenie cca 40 kb sekvenčná mapa kompletná nukleotidová sekvencia DNA rozlíšenie 1 bp

HGP: hierarchická stratégia sekvenovania („clone-by-clone“) triangulovať genóm pomocou STR zostrojiť BAC-knižnice mapovať klony do STR mapy utvoriť BAC kontigy štiepiť BAC-y náhodne na sekvenovateľné fragmenty sekvenovať fragmenty zoradiť do konečnej sekvencie klonu zoradiť sekvencie klonov do definitívnej sekvencie anotovať sekvenciu

HGP: Francis Collins a Eric Lander Francis Collins: chromosome walking a jumping; leví podiel na pozičnom klonovaní génu pre cystickú fibrózu Eric Lander: pôvodne matematik, množstvo významných výsledkov v mol. genetike – napr. genetická mapa myši, nové prístupy k mapovaniu u človeka – privilegované postavenie (mohol si vybrať chromozóm) – vynikajúci pedagóg – na ďalšom obrazku vidíme, ako učí pipetovať tibetského dalajlamu –

Nárast údajov o sekvencii 1996-2001

1998 - Craig J. Venter a Celera Genomics

Stratégia sekvenovania: Celera Genomics Celogenómová shotgun stratégia sekvenovania Skombinovanie s dátami HGP Utvorenie knižníc s definovanými dĺžkami (2,10,50 kb)

HGP v Bielom Dome, jún 2001

http://vega.sanger.ac.uk/Homo_sapiens/ www.ensembl.org Nature 431, 931 - 945 (21 October 2004); doi:10.1038/nature03001 Finishing the euchromatic sequence of the human genome INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM http://vega.sanger.ac.uk/Homo_sapiens/ www.ensembl.org

Dokončená sekvencia (2004): základné údaje pokrýva 2,85 Gb; celý genóm má 3,08 Gb pokrýva > 99% euchromat. genómu sekvenačné chyby zriedkavejšie ako 1 : 100 000, priemerné pokrytie 11-násobné len <350 medzier (väčšinou heterochrom. úseky a vysoko repetitívne sekvencie) 20 000 – 25 000 proteíny kódujúcich génov (22 287) priemerne 9 génov na Mb; veľká variabilita 232 000 exónov; v priemere 10,4 exónu na gén; exóny tvoria len 1,2% dĺžky sekvencie identifikovaných cca 20 000 pseudogénov, asi ich je viac ako génov segmentové duplikácie tvoria 5,3% euchromatickej sekvencie („evolutionary gene nurseries“) ale pozor: anotácia sekvencie stále ešte nie je dokončená!

HGP: možnosti využitia Etiológia genetických a nádorových ochorení Diagnostika monogénnych a nádorových ochorení Diagnostika multifaktoriálnych ochorení Génová terapia (genetických a nádorových ochorení) Cielená liečba („molekulárna farmakológia“) Štúdium biologických funkcií na molekulárnej úrovni (diferenciácia, starnutie ...) Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií Nosce te ipsum: podstatný krok k poznaniu biológie nášho druhu Podstatná časť práce je ešte len pred nami

Pozične klonované gény s využitím HGP sekvencie