Šlechtění vegetativně množených rostlin Klonová selekce, techniky „in vitro“

Klonování Vegetativní způsob rozmnožování Fixace genotypu Vysoký generační potenciál Odolnost vůči mutacím Ekologicky výhodný způsob v ekologicky stabilních podmínkách V dynamicky se měnících podmínkách je nevýhodný

Klonování z pohledu šlechtění Konzervace genofondu vybraných genotypů Genetické zdroje Udržovací šlechtění Fixace vlastností odrůdy Garance vysoké stability odrůdy Výroba rozmnožovacího materiálu Důraz na udržení biologické hodnoty RM Relativně nákladný způsob množení Důraz na ekonomickou efektivitu produkce

Odrůda typu klon a DUS Vysoká heterozygotnost genotypu (značné štěpení potomstva vznikajícího generativně) Unikátní vlastnosti (mnohdy neopakovatelná kombinace genů) Téměř absolutní uniformita v klonu Značná stabilita vlastností odrůdy

Principy stability v průběhu klonování rozmnožovací materiál = vegetativní část rostliny vznikající díky dělení buněk mitózou a následným vývojem pupenů Hlízy stonkového a kořenového původu Odkopky, řízky (ovocné keře, podnože, chmel) Pupeny, rouby (ovocné stromy) Dělení trsů u okrasných rostlin Oddenky, šlahouny (máta, jahody) Cibule (okrasné rostliny, česnek) Meristémy

Hlavní veg. množené plodiny v ČR Jednoleté kultury Brambory (125 odrůd) Česnek (22 odrůd) Víceleté kultury Chmel (6 odrůd) Vinná réva (57 odrůd) Ovocné dřeviny (119 jabloň) Drobné ovoce (31 jahodník)

Variabilita v rámci klonů Negenetická variabilita Zdravotní stav Nevhodné podmínky prostředí Genetická variabilita Somaklonální variabilita – chimerismus Rubín - Bohemia

Šlechtění veg. množených rostlin Tvorba výchozího materiálu Výběr z přírodních populací Křížení Mutageneze Somaklonální variabilita Somatická hybridizace Klonová selekce Výběr a popis, množení udržování zdravotního stavu

Klonová selekce 1. generativní potomstvo štěpí Preselekce pomocí genetických markerů Selekce na fenotypové úrovni Výrazná redukce genotypů Nárůst četnosti jedinců v rámci klonů Udržování zdravotního stavu Technický izolát Udržování „in vitro“

Stupně klonové selekce - obecně 1. Semenáče 2. A – klony 3. B – klony 4. C – klony 5. V1 – předzkoušky 6. V2 – hlavní zkoušky 7. Státní odrůdové pokusy

Klonová selekce - brambor 1. rok – semenáče (skleník) 180 000 2. rok – hlízový ramš A 80 000 3. rok – ramš B 25 000 4. rok – A. klony 8 000 5. rok – B. klony 2 000 6. rok – C. klony 400 7. rok – předzkoušky 1 80 8. rok – zkoušky 20 9. – 11. rok – SOZ 4 - 2

Hodnocení v klonových generacích Selekce probíhá na základě polních a laboratorních testů současně (provokační testy) Přítomnost viróz vylučuje klon z další selekce – hodnocení vizuálně a ELISA testem Po pátém roce probíhá ozdravení v in vitro podmínkách (před předzkouškami)

Šlechtění bramboru obrazem

Detekce virů, bakterióz a MLO Základem běžné diagnostické metody Sérologické metody DAS ELISA NCM ELISA Imunofluorescence Analýza DNA či RNA RT – PCR Standardní PCR R - PAGE

Ozdravování od viróz Termoterapie Chemoterapie Kombinace obou metod Kultivace při 30 – 35°C, snižuje titr viru vprodlužovací zóně Chemoterapie Ribavirin (20mg/l média, 10 týdnů) Kombinace obou metod Urychluje ozdravení

Produkce rozmnožovacího materiálu In vitro klony Meristematické kultury Technický izolát (skleníky) Omezuje nálet vektorů virů Užívá se pro kultivaci předstupňů Aeroponie nebo hydroponie – tvorba minihlízek Produkce v polních podmínkách omezený počet generací v místech s nízkou letovou aktivitu vektorů insekticidní ochrana a monitoring desikace

Aeroponie bramboru

In vitro kultury Kultury ve skle Intenzivní rozvoj od 60 let 20. Století Dnes intenzivní využívání v oblasti výzkumu šlechtění a konzervace genofondu rostlin Široká využitelnost Značný kultivační potenciál Technologicky náročné

Nezbytné podmínky realizace Kultivační podmínky Aseptická práce vyžaduje aseptické prostředí Pracovně náročné – manipulace s materiálem Kompletní řízení kultivačních podmínek Světlo, teplo, výživa Technologická nákladnost Energie, voda, investiční náklady, materiál

Nezbytné podmínky realizace Aseptické prostředí Fyzikální sterilizace Autoklávování Gamazáření Plamen Chemická sterilizace Ethanol Aseptická práce Flowbox – laminární box

Nezbytné podmínky realizace Kultivace Mobilní kultivační skříně Stacionární kultivační síně

Média Různé druhy kultivačních půd Tekutá média Ztužená média Makroprvky, mikroprvky, jednoduché sacharidy Růstové regulátory (IAA, NAA, BAP, zeatin, GA3) Ztužovadla (agar, agaróza, fytagel) Tekutá média pro kultivaci buněk a kalusů Ztužená média Kultivace rostlin, zakořeňování

Aplikační možnosti Mikropropagace Konzervace Indukce - regenerace Meristemové kultury Mikrovýhonky Mikrohlízky Konzervace Inhibitory růstu (daminozid, Alar 85) Omezené růstové faktory (teplota a světlo) Indukce - regenerace Kalusové kultury Buněčné kultury

Buněčné kultury Protoplast – rostlinná buňka zbavená buněčné stěny Celuláza + macerozym Osmotikum (sorbitol, mannitol…) Přečištění centrifugací v gradientu sacharózy Rozpuštění v tekutém nebo tuhém médiu Fúze v elektrickém poli nebo v prostředí PEG – somatická hybridizace

In vitro ve šlechtění Mutageneze Androgeneze a gynogeneze Somaklonální variabilita Somatická hybridizace Transgenoze Ozdravování a mikropropagace