Vysoké učení technické v Brně MIKROSKOPIE KONFOKÁLNÍ A AFM 2013 Laboratoře – Ústav fyziky – Fakulta stavební

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100 Aplikace: Lomové plochy Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy) Analýza: Drsností Profilů Částic Objemová analýza přímo ve 3D zobrazení

PRVKY KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU Optické prvky jsou uzpůsobené vlnové délce laseru o λ = 408 nm: Zdroj Objektiv Konf. opt. clonka Fotonásobič Detektor CCD (snímání barevného obrazu-RGB) fotoefekt

PRINCIP KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU Osvětlení: Bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonku) čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonkou. Clonka: Je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím difrakční mezi mikroskopu Objektiv: Sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené Zpětný průchod objektivem: Obraz bodové clonky => fotonásobič => druhá konfokální bodová clonka (blokující)

HISTORIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světla M. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope Koncem 70. let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskemm laserovým paprskem

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ „Klasická“ mikroskopie: Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátu (vzorku) Při zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. Lze zkoumat jen vzorky o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Z min = 0,25 nλ/NA 2 ). Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužky Difrakční obrazec vzniká ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými.

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ Konfokální mikroskopie tyto nevýhody odstraňuje nicméně má navíc výhody i nevýhody: Výhody: Potlačení mlhavého pozadí obrazu Optická tomografie Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.) Nevýhody: Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detekovaných fotonů. Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření (Interakce s /fluorescenčním/ preparátem)

SROVNÁVACÍ SNÍMKY Nekonfokální mikroskop Konfokální mikroskop Rastrující konfokální mikroskop: U něj skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku – velmi efektivní pro sestavování 3D modelů Rastrování (obraz celé zaostřené roviny se získává bod po bodu následovně): Rozmítáním laserového paprsku Příčným posuvem vzorku před objektivem Posuvem objektivu nad vzorkem Optické řezy: Optické řezy se pohybují v řádech mikrometrů (dle numerické apertury a využitého laseru)

PRACOVIŠTĚ ÚSTAVU FYZIKY

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 120 x Rastrů 250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 480 x Rastrů 250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ Ilustrativní obrázky Extren – vlákno - matrice Dioda – řez katodou

Vysoké učení technické v Brně AFM MIKROSKOPIE 2013 Laboratoře – Ústav fyziky – Fakulta stavební

AFM - ATOMIC FORCE MICROSCOPY Aplikace: Povrchy pevných látek Nanotechnologie Vodivé i nevodivé materiály Analýza: Chemická analýza (identifikace) Katalické procesy Konstrukce nanostruktur Částic

PRVKY AFM MIKROSKOPU Optické prvky jsou uzpůsobené vlnové délce laseru: Zdroj MZ Cantilever Tip Fotodetektor Soustava zrcadel

PRINCIP AFM MIKROSKOPU Osvětlení: Bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na Cantilever) Odraz a detekce: Dle zákonu odrazu dopadá na fotodetektor, kde se dá z místa dopadu svazku určit velikost ohnutí Cantileveru Zobrazení a bezkontaktní princip: Zvětšený obraz povrchu vzorku se sestavuje z různého ohnutí Cantileveru v různých místech. Bezkontakní princip je založen na využití Van der Walesových sil a elektrost. sil

AFM ROZLIŠENÍ Závislé na: –poloměru křivosti špičky hrotu (cca. 5 nm) –velikosti obrazu (1 x 1 μm, 512 x 512 měřících bodů) V tomto případě rozlišení 2 nm Zvětšení snímané plochy – pokles rozlišení Zmenšení snímané plochy – rozlišení se nezvětší ( ~ poloměr křivosti špičky hrotu) Obecně lze využít rozlišení stovky mikrometrů až nanometry (lze pozorovat periodickou strukturu atomové mříže, jednotlivé atomy zobrazit nelze) V r bylo s použitím DFM (mikroskopie dynamických sil) dosaženo zatím největšího rozlišení 77 pikometrů (77×10 −12 m). V tomto rozlišení je možné rozeznat struktury uvnitř jednotlivých atomů

HISTORIE AFM Ve 30. letech minulého století byl sestaven první elektronový mikroskop (v Německu inženýry Ernstem Ruskou a Maxem Knollem). Klíčové zde bylo využití de Broglieho popisu vlnové povahy toku elektronů a elektrostatických a elektromagnetických čoček. Šlo o tzv. transmisní elektronový mikroskop (TEM), který měří míru rozptylu elektronového paprsku po průchodu tenkou vrstvou zkoumaného vzorku. Roku 1981 Gerd Binning a Heinrich Rohrer vynalézají řádkovací tunelovací mikroskop (scanning STM). Jde o první řádkovací mikroskop za použití sondy. Objev STM vedl k sestrojení mikroskopu atomárních sil (AFM). V roce 1989 výzkumník Don Eigler z IBM objevil, že za určitých podmínek sonda STM přitahuje atom na povrchu krystalové mřížky a může s ní pohybovat po tomto povrchu (Van der Waalsovu sílu). Rozvoj vedl ke zkracování vykreslovací doby (až k vykreslování v reálném čase, videoAFM), ke zvětšování rozlišovací schopnosti (až ke zkoumání orbitalu ohmatáním sondou AFM) a umožnil mnohé praktické aplikace.

SROVNÁNÍ S OPTICKOU A ELEKTRONOVOU MIKROSKOPIÍ Výhody AFM: Ve srovnání s optickou mikroskopií dosahuje značně většího rozlišení, které je srovnatelné s rozlišením elektronové mikroskopie. AFM však poskytuje trojrozměrný obraz, kdežto elektronová mikroskopie dvojrozměrnou projekci. AFM zpravidla nevyžaduje, aby se vzorek speciálně připravoval (např. pokovením) ani nevyžaduje vysoké vakuum. AFM může dokonce pracovat v kapalném prostředí, což je výhodné především pro studium biologických vzorků, které mohou být při zobrazování ve svém fyziologickém prostředí a lze v některých případech sledovat jejich funkci nebo reakci na změnu prostředí (změna pH, teploty, chemického složení). Mikroskopie se dostává až na hranici pikometrové oblasti

SROVNÁNÍ S OPTICKOU A ELEKTRONOVOU MIKROSKOPIÍ Nevýhody AFM: AFM může zobrazovat pouze povrch vzorků, nikoliv jejich objemovou strukturu (vzorek vyžaduje fixaci, nemůže například plavat v roztoku). Nevýhodou AFM je velmi omezený rozsah velikosti obrázku a pomalost snímání. Maximální velikost obrazu bývá řádově stovky mikrometrů a sestavení jednoho obrazu trvá řádově minuty. Nevýhodou AFM mikroskopu je malý rozměr skenovaných vzorků maximálně ve stovkách mikrometrů, tedy přibližně 0,5 x 0,5 mm (vertikální rozsah - maximální výška vzorku řádově desítky mikrometrů). Problémy způsobuje také blízkost hrotu a vzorku (silná interakce, možnost zachycení hrotu, znečištění hrotu, poškození vzorku) a nenulová šířka hrotu, která vede k deformaci obrazu.

SROVNÁVACÍ SNÍMKY AFM mikroskop

PRACOVIŠTĚ ÚSTAVU FYZIKY

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ

Děkuji za pozornost