Dynamika buňky Cytoskelet Buněčné kontakty Motorové proteiny Aktivní pohyb

2.1 Cykoskelet Dynamická struktura, vlákna + asociované proteiny Funkce: 1)Mechanická opora buňky, soudržnost buněk 2)Vnitrobuněčný transport 3)Vnitřní organizace, polarizace buňky, pohyb 4)Dělení buňky Typy cytoskeletu (eukaryota): 1)Aktinová filamenta (mikrofilamenta) 2)Intermediátní filamenta 3)Mikrotubuly

Dynamika cytoskeletu Cytoskeletární vlákno = polymer podjednotek Polymerace x odbourávání Orientace vláken: [+] a [-] konce Kritická koncentrace: k on x C c = k off

Aktinová filamenta 5-9 nm Dvouvláknová helikální struktura Podjednotky: Polymery aktinu Váže ATP/ADP Funkce: Kortex (vrstva pod membránou) Panožky, mikrovily (tvar a pohyb) Svalová kontrakce Transport Dělení buňky (kontraktilní prstenec)

Polymerace aktinu Polymerace: ATP-aktin - vazba - hydrolýza ATP ([+] konec) [+] konec roste rychleji než [-] Regulace polymerace: Profilin - ATP/ADP exchange factor, pomáhá polymeraci Thymosin - váže ATP-aktin, inhibice assembly VIDEO

Proteiny asociované s AF CAP - stabilizace [+] konce ARPs (actin related proteins) [-] konec, nukleace, větvení Svazky aktinových vláken Myosin - buněčný motor VIDEO

Mikrotubuly 25 nm Duté trubice - 13 protofilament Podjednotky: Dimery α a β tubulin, vazba GTP Funkce: Intracelulární transport Pohyb buněk (bičíky) Dělení buňky - rozchod chromozómů MTOC = microtubule organizing center Centrozóm (2 centrioly)

Polymerace tubulinu γ tubulin - nukleační centrum ([-] konec), prstenec, v MTOC αβ tubulin (dimer): růst vlákna

Dynamika mikrotubulů Dynamická nestabilita - GTP čepička (růst) x katastrofa VIDEO

Proteiny asociované s mikrotubuly Stathmin - vyvazuje podjednotky Catastrophin - destabilizace mikrotubulů Stabilizační MAP Capping proteins

Intermediátní filamenta 10 nm Polymery filamentárního proteinu Jaderné (lamin) x cytosolické Pouze metazoa (cytosolické) Funkce: Jaderný obal (asociace a rozpad) Opora buňky, tvar, buněčné spoje Více druhů cytoplazmatických IF (podle buněčného typu): Epitel - keratin Neuron - neurofilamenta Sval - desmin Různé mezenchymální buňky - vimentin Keratin

Polymerace intermediátních filament Menší dynamika Neváží ATP ani GTP Mechanická odolnost

2.2 Buněčné kontakty Jak drží buňky pohromadě? Extracelulární matrix (ECM) Mezibuněčné spoje Pojivové tkáně - mechanický stres, vláknité polymery (kolagen) Epithel - ECM: basální lamina, mezibuněčné spoje Typy buněčných spojů: 1)Těsnící spoje 2)Kotvící spoje 3)Komunikační spoje

Těsný spoj (tight junction) Pásový spoj Umožňuje rozlišení různých částí membrány Brání difúzi látek mezi buňky (např. střevní epithel) Kotevní spoje Cell-cell: Cytoskelet-kotva-kotva-cytoskelet Adhezní spoje, desmozómy (cadheriny) Cell-ECM: Cytoskelet-kotevní protein-ECM Fokální adheze, hemidesmozómy (integriny)

Cell-cell kotevní spoje Adhezní spoj: pásový spoj např. epithely Aktinové svazky Cadheriny A-C-A-C... (transcelulární síť) Kontrakce - trubicové struktury Regulované kontakty Desmozóm: Intermediátní filamenta Plakový spoj Cadheriny Rozložení pnutí a tlaku

Cell-ECM kotevní spoje Fokální adheze: Aktinová filamenta Integriny Hemidesmozómy: Intermediátní filamenta Integriny Napojení na bazální laminu VIDEO

Komunikační spoje Gap junctions (mezerové spoje): Connexiny - kanály H. sapiens 14 typů connexinů Propustnost podle typu Elektrická synapse Synchronizace tkáně Plasmodesmata: Buněčné spoje u rostlin Včetně ER Transport látek Šíření virů

Epitheliální buňka - buněčné spoje

2.3 Motorové proteiny Přeměna energie - konají práci Motorové proteiny asociované s cytoskeletem: 1)Intracelulární transport (váčky) 2)Buněčný pohyb (E. bičíky, brvy) 3)Svalová kontrakce 4)Dělení buňky (kontraktilní prstenec, rozchod chromozómů) Rotující motory: 1)Helikáza 2)ATP syntáza 3)Bakteriální bičík Energie: ATP (GTP), transport H + přes membránu po gradientu Souvislosti: Buněčná reprodukce

Cytoskeletární motorové proteiny Cyklická vazba a hydrolýza ATP - konformační změny 2 způsoby pohybu: Kargo (náklad) - pohyb podél cytoskeletu Vůči buňce se pohybuje cytoskelet (bičík) Proteiny asociované s mikrotubuly: Kinesin - pohybuje se k [+] konci Dynein - pohybuje s k [-] konci Proteiny asociované s aktinovými vlákny: Myosinová rodina (např. myosin I, myosin II) VIDEO

Dynein a kinesin Kráčivý pohyb, druhý konec váže kargo Kinesin a příbuzné proteiny VIDEO

Myosinová rodina Asociace s aktinem Pohyb k [+] konci VIDEO Myosin II: struktura

Myosinová rodina Myosin - transport (např. mRNA) (zde ash1 mRNA do pupene) Myosinová rodina: hlava - konzervovaná sekv. Svalová kontrakce

Rotující motory F ATPáza, helikáza (strukturní homology) Motor bakteriálního bičíku Helikáza: dsDNA→ssDNA (spotřeba ATP) Homohexamer - ale není šestičetná symetrie 3 místa - ATP, ADP + Pi, volné F ATPáza: transport protonů → syntéza ATP štěpení ATP → transport protonů VIDEO

F ATPáza = ATP synthetáza NC 1997: Walker, Boyer A) Rotace Dva polokanály (z MMP, z matrix) 1. c podjednotka (Asp) - vazba H + 2. Rotace 3. Uvolnění H + Jednosměrná rotace (deprotonovaný Asp je hydrofilní) B) ATP synthéza Rotace - změna konformace Hexamer (3x α 3x β) 3 místa (cyklická změna): Open, Loose, Tight VIDEO

Motorové proteiny - metody Optická past (měří sílu myosinu) Pohyb značených aktinových vláken Důkaz chemiosmotické teorie Rotace ATP syntázy VIDEO Pozorování indiv. molekul VIDEO

Mechanicky řízená syntéza ATP 1. Izolovaná ATP syntáza (F1) - immobilizace (HIS tag) 2. Navázání magnetické kuličky 3. Rotace (elektromagnety) 4. Syntéza ATP (ADP+Pi) 5. Luciferáza (štěpení ATP, emise) 6. Detekce countů Itoh, H. et al.: Nature Jan 29;427(6973):465-8.

2.4 Aktivní pohyb 1)Svalová kontrakce (aktin + myosin) 2)Améboidní pohyb (aktin) 3)Eukaryotické bičíky a brvy (tubulin + dynein) 4)Bakteriální bičíky (protonový pohon, rotace) VIDEO

Svalová kontrakce Obratlovci: 1.Příčné pruhovaná svalovina 2.Hladká svalovina 3.Srdeční svalovina Sarkomera = jednotka svalu Actin/myosinová vlákna Regulace pomocí Ca 2+ Titin, tropomodulin, Z cap Troponin, tropomyosin

Svalový cyklus 1.Nervový impuls (acetylcholin) 2.Depolarizace buňky (vstup Na + ) 3.Otevření Ca 2+ kanálů (sakroplazmatické retikulum) 4.Změna uspořádání komplexu (troponin/tropomyosin) 5.Svalová kontrakce (ATP) 6.Ca 2+ pumpa (ATP) 7.Relaxace VIDEO

Améboidní pohyb Výběžky cytoplazmy: filipodia (1D), lamellipodia (2D), pseudopodia (3D) Push and pull mechanismus: 1.Vypoulení membrány (assembly aktinu) 2.Fokální adheze 3.Změna tekutosti cytoplazmy (sol→gel), naplnění výběžku 4.Kontrakce zadní části (myosin) Listeria monocytogenes - intracelulární parazit, aktinové ocásky VIDEO

Eukaryotický bičík Prvoci, spermie, bičíkatá stadia řas Průřez bičíkem = tubulinová vlákna (9+2) Dynein: Pohyb po vlákně a zároveň vazba jiného vlákna Ohnutí (vlákna jsou ukotvena)

Bakteriální bičík Mechanizmus připomíná F-ATPázu (ATP syntázu) 1.Protonová pumpa (mezimembránový prostor) 2.Bičíkový motor (rotor + stator)

Shrnutí Cytoskelet = dynamická struktura: mechanická opora, buněčná soudržnost, transport, pohyb, reprodukce buňky Aktinová filamenta, intermediátní filamenta, mikrotubuly Molekulární motory: 1)Interagující s cytoskeletem (myosin, dynein, kinesin) Doprava karga, svalová kontrakce, eukaryotický bičík, améba 2) Rotační proteiny ATP syntáza, DNA helikáza, bakteriální bičík Pohyb: Svalová kontrakce Améboidní (panožky) Bičíky a brvy (eukaryota x bakterie)