SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU 4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU

Vývoj spermií - spermiogeneze Začíná v době pohlavní dospělosti V semenotvorných kanálcích varlat Cyklicky se opakuje, jeden cyklus 40 – 70 dní Každý cyklus začíná o ¼ délky později Ve stěně kanálku 4 buňkové generace nad sebou Semenotvorné kanálky zárodečný epitel s prvopohl. buňkami Sertoliho podpůrné buňky

Spermiogeneze  spermatohistogeneze Období rozmnožování (mitotické dělení) Období růstu Období zrání (meiotické dělení)  spermatocytogeneze Období metamorfózy  spermatohistogeneze

Ad 1) Období rozmnožování Opakované mitotické dělení původních kmenových buněk A – spermatogonií (primordiální gonocyty) Rozdělení na dvě buňky: Typ A: velké, mateřské zásobní buňky, latentní stádium Typ Im : intermediární buňky, dále se dělí na: Buňky typu B  další dělení  spermatocyty 1. řádu

Ad 2) Období růstu Spermatocyty 1. řádu zvětšují svůj objem Ad 3) Období zrání Dvě po sobě jdoucí zrací dělení Redukce počtu chromozomů na polovinu, rekombinace genetických vloh Spermatocyty 1.řádudva spermatocyty 2.řádu čtyři spermatidy Poměr X a Y spermatid = 50:50

Ad 4) Období metamorfózy Spermatida  spermie Ve výběžcích Sertoliho buněk Dílčí stádia: Golgiho, stadium akrozomové čepičky, stadium kaudální manžety, stadium zrání Jádro se prodlouží a oploští  hlavička Golgiho aparát  akrozom Buněčné centrioly  krček a bičík Uvolnění spermií do lumen semenotvorných kanálků a vývodných cest Postup do ocasu nadvarlete cca 12 dní

Schéma spermatogeneze

Fáze spermatogeneze

Stavba varlete a nadvarlete býka

Denní produkce spermií Býk denně 2,5 x 109 spermií ( jeden gram testikulární tkáně vyprodukuje za 1 minutu 5-10x103 spermií) Kanec denně 15x109, druhý rok až 31x109 Hřebec 6x109 spermií denně, rezerva až 20x109 U vyčerpaných nutná sexuální pauza 4-7 dní

Rozměry spermií (mikrony) Celková délka Délka hlavičky Šířka hlavičky Býk 75-80 9-10 4-5 Beran 70-80 8-9 Kanec 50-60 7-10 Hřebec 55-60 5-8 2-5 Králík Drůbež 50-120 7-14 0,5

Spermie různých druhů savců

Mikrostruktura spermie

Mikrostruktura spermie Hlavička spermie: 51% hmotnosti spermie Její úloha je přenést dědičný materiál v nukleoplazmě Přední část kryta čepičkou – akrozomem Akrozom Cytoplazmatický útvar, složen z mukopolysacharidů Zaujímá 50% plochy hlavičky Nositelem specifických enzymů (hyaluronidáza, akrozin, proakrozin, kyselá fosfatáza, proteináza aj.), které rozpouštějí zonu pellucidu a cytoplazmatický obal vajíčka Citlivost na osmotické změny vnějšího prostředí (bobtnání, oddělení) Dobře barvitelný

Mikrostruktura spermie Krček Spojuje hlavičku s bičíkem, 2-3µm Dva za sebou uložené centrioly, distální centriol obklopen devíti příčně segmentovanými provazci = chordami Hlavice bičíku zapadá do implantační jamky, kloubové spojení Bičík Transport spermie Mitochondriální aparát – tvorba energie Axiální vlákna – přeměna na mechanickou energii Spojovací část bičíku: Pokračováním krčku, ukončena distální centriolou Osové vlákno – 9+2 fibril + chordy (hrubá vlákna) Spirálovitá pochva – mitochondrie – respirační aparát

Mikrostruktura spermie Hlavní část bičíku: Tenčí než spojovací část Podkladem je komplex vláken 2+9+9 Chordy tenčí, slepě končí Osová vlákna obaluje fibrózní pochva – pevnost a pružnost pro kmitání Koncová část bičíku: Osové vlákno není obaleno pochvou Na povrchu cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána Pokrývá celou spermii, citlivá na změnu osm.tlaku Velká permeabilita (látková výměna) Rezistentní vůči kyselému prostředí Nepropouští barvivo  metoda vitálně letálního barvení (rozlišení mrtvých a živých spermií) Odumřením ustává permeabilita

Fyzikálně chemické vlastnosti spermatu Směs spermií a semenné plasmy Husté sperma: býk, beran, kozel Řídké sperma: hřebec, kanec Objem a hustota biologicky uzpůsobeny poměrům depozice do pohlavních orgánů – intravaginální x intracervikální

Parametry spermatu cm3 Sper. v mm3 Býk 2 – 10 5 0,2 – 2,0x106 1,0x106 Ø Sper. v mm3 Býk 2 – 10 5 0,2 – 2,0x106 1,0x106 Beran 0,5 – 2 1 0,5 – 5,0x106 3,0x106 Hřebec 20 – 300 70 0,03 – 0,8x106 0,12x106 Kanec 100 – 500 250 0,05 – 0,5x106 0,25x106 Králík 0,4 – 2,0 Kohout 0,1 – 1,5 0,5 – 7,0x106 Krocan 0,2 – 1,0 0,5 3,0 – 7,0x106 4,0x106 Kačer 0,05 – 3,0x106 Houser 0,2 – 1,5 0,8 0,5 – 1,5x106 Muž 2,0 – 6,0 3,5 0,05 – 0,15x106 0,1x106

Životní projevy spermií Spotřeba energie – metabolické pochody Zdroj energie – fruktóza (glukóza), kys.mléčná Fruktolýza (glykolýza)  kyselina mléčná Dýchání (respirace)  kys.mléčná do Krebsova cyklu Průběh metabolismu: V nadvarleti inaktivace: nižší teplota, pH 5,6 – 6,6, vyšší koncentrace CO2, nedostatek fruktózy V semenné plasmě (ředidle) a pohl. orgánech samice aktivace

Životní projevy spermií GLYKOLÝZA Anaerobní (bez přístupu O2) Enzymy α a β-glukosidáza Kys.mléčná – pokles pH Energie:  60% teplo, 40% pohyb Býk, beran, kozel C6H12O6+enzym  2CH3 . CHOH . COOH+E Glukóza,manóza,fruktóza,maltóza (disacharid) Hřebčí a kohoutí spermie využívají jen glukózu INDEX FRUKTOLÝZY = množství fruktózy spotřebované při 37oC v anaerobních podmínkách za 1 hodinu na 109spermií Býk 25mg, hřebec a kanec 0,2mg Přímo úměrný koncentraci a životnosti spermií

Životní projevy spermií RESPIRACE Aerobní metabolismus cukrů Přeměna kyseliny mléčné 19x účinnější: 40% teplo, 60% pohyb 0,3 ml O2 na 109spermií za 1 hodinu C6H12O6 + 6O2  6 CO2 + 6 H2O + E Beraní spermie vyčerpají fruktózu v ejakulátu za 15 min, další zdroj energie = fruktóza a kys. mléčná v sekretu pohl. ústrojí samice Respirace probíhá i v pohl. orgánech samice

Pohyb spermií V nadvarleti nepohyblivé Pohyb při styku se sekretem příd. pohl. žláz Zralá a zdravá spermie má přímočarý progresivní pohyb vpřed za hlavičkou Způsoby pohybu: Kmitáním bičíku Otáčivé pohyby kolem podélné osy Nejrychlejší pohyb v čerstvém spermatu Pohyb začíná od báze hlavičky a probíhá po celé délce bičíku 9 vln a 3-15 otoček za vteřinu

Pohyb spermií Hromadný pohyb: aktivní spermie rozvlní a uvedou do pohybu plasmu, která unáší spermie náhodným směrem Centrum pohybu: v proximální centriole krčku Směr pohybu: V ejakulátu nahodilým směrem V pohl. orgánech reotaxe = schopnost pohybu proti proudu tekutiny Rychlost spermií se zvyšuje s rychlostí proudící tekutiny, orientují se podle proudu Nežádoucí pohyb: Krouživý (může být vydatný) Otáčivý (kolem hlavičky) Vlnivý na místě Zpětný Aglutinace = shlukování spermií, ztráta záporného el. náboje (pokles pH, staré sperma)

Vlivy působící na aktivitu spermií Teplota Největší pohyb při 38-41oC Při 0oC se pohyb zastavuje Při 48 – 50oC dochází ke koagulaci bílkovin optim. teplota pro uchovávání spermatu je 0-3oC u býčích spermií kritická teplota 15 – 17oC – dochází k tepelnému šoku při -1 až -17oC dochází k intenzivní krystalizaci pH Nejpříznivější 6,8 až 7,5 Pod 6,0 a nad 8,0 spermie hynou Osmotický tlak – pouze izotonický Světlo – nepříznivě působí sluneční paprsky

Rychlost transportu Prasnice Krávy a ovce Spermie ve vejcovodu za 40 min. (průměrně 1-2 hod) Krávy a ovce Spermie ve vejcovodu za 4 až 6 hodin Průchod krčkem 30 min. Průchod dělohou 2 hod. Průchod vejcovodem až 8 hod. Při vaginální inseminaci zůstává 95% spermií ve vagíně

Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice Vnější pohlavní stimulace: Stahy svaloviny genitálního traktu Působení estrogenů Stimuly: Přítomnost samce, doteky mulcem, vzeskoky Masáž vulvy, klitorisu, krčku Zavedení katetru Aplikace oxytocinu, PGF2α U prasnice tlak na bedra Objem zavedené tekutiny Stres: faktor strachu – adrenalin snižování aktivity dělohy, zpomalení transportu

Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice Objem a koncentrace spermií v ID: Norma : skot 10 – 12x106 spermií prasata 1,5x109 spermií Pokusy s počtem spermií v ID U skotu se nesnížila plodnost při 9 – 14 x 106 sperm. U prasat 1 – 5 x 109 sperm. Selekce spermií na úrovni uterotubálního spojení Do vejcovodů přicházejí živé i mrtvé spermie Semenná plasma Obsahuje PGF2α  kontrakce (kanec cca 1ng PGF2α v 1ml ) Při ředění se obsah PGF2α snižuje (opt. 1:15)

Semenná plazma Prostředí pro spermie (výživa, pohyb) Ochrana proti nepříznivým vlivům Výměšky nadvarlat, Cowperových žláz, prostaty, semenných váčků, uretrálních žláz, ampulí chámovodu Výměšek nadvarlat: Bílkoviny, lipidy, K, Na pH 5,6 – 6,6, dlouho přežívají spermie Cowperovy žlázy U kance 200ml (15-18%) Odchází na začátku – zvlhčuje cesty U kance po spermiích – hustý, naplňuje děl. krček,tvoří zátku Ampule chámovodu u býka sekret s vysokou hladinou fruktózy a kys. citronové, Ca,Na,K

Semenná plazma Semenné váčky: Prostata: Uretrální žlázy: Bílkoviny, fruktóza, kys. citrónová pH 5,7 – 6,2 U býka 40 – 60%, u kance 20 – 25% Na konci ejakulace, zdroj energie Prostata: pH 6,5 – 8,0 Upravuje reakci močové roury adrenalin,prostaglandin – ovlivnění děložních kontrakcí Specifický zápach Uretrální žlázy: První frakce už při erekci pH 8,0, šedobílá barva, 1-5ml.

Podíl semenné plasmy býk 80 – 85% beran 70 – 75% kanec 93 – 95% hřebec 90 – 95%

Vlastnosti semenné plasmy Osmotický tlak: Isotonie = rovnováha Hypotonický roztok: bičík se spirálovitě stáčí, spermie bobtnají Hypertonický roztok: plasmolýza, spermie se svrašťují, bičík se skládá jako pila Koncentrace vodíkových iontů: U čerstvého spermatu pH kolem 7,0 Při fruktolýze  kys. mléčná, pH klesá pH 6,0 – anabioza, pH 5,5 – 5,0 odumření spermie Plasma býka pH 6,6 – 6,8 kance pH průměrně 7,0 hřebce pH průměrně 7,5 berana pH průměrně 7,0

Zásady ředění a uchování spermatu cílem je uchovat oplozovací schopnost spermií in vitro ředění spermatu: větší objem, přežití spermií in vitro  uchování vitality a fertility, jen za stavu anabiózy konzervační roztok: stejné fyzikálně – chemické vlastnosti chrání spermie před produkty metabolismu zabraňuje chladovému šoku

Komponenty používaných ředidel vaječný žloutek: obsahuje výživné látky, ochranné koloidy zvyšuje odolnost spermií proti chladovému šoku pufrovací schopnost, antikoagulační účinek nevýhoda: živná půda pro zárodky  používání pouze čerstvých vajec (max 10 dnů stáří) od slepic z chovů prostých nákaz mléko: pufrovací roztok, zabraňuje aglutinaci snižuje nebezpečí chladového šoku používá se plnotučné, odstředěné, homogenizované, laktóza kryoprotektiva: zabránění chladovému šoku glycerin výživné látky: fruktoza, laktoza, kys. citronová antibiotika: streptomycin, penicilin, linkomycin, spektinomycin po přidání antibiotik ponechat min 45 min při 5oC

Ředidla pro krátkodobé uchování žloutko-citrátové: žloutek+citronan sodný žloutko-mléčné: žloutek+mléko ředidlo ze sušeného mléka: Sunar+ destilovaná voda Kare I, II: EDTA, pro kančí sperma

Ředidla pro dlouhodobé uchování TRILADYL komerční ředidlo dodávané v koncentrované formě dest. voda, glycerol, kys.citronová, fruktoza, antibiotika do koncentrátu destilovaná voda + vaječný žloutek, zahřátí na 30oC LAKTÓZOVÉ ŘEDIDLO 11% vodný roztok laktózy, vaječný žloutek, glycerin míchání ve sterilním prostředí, přidávání antibiotik TRIS destilovaná voda, tris, kys.citrónová, fruktóza, antibiotika TRIS = hydroxymethyl - aminometan přidání žloutku + glycerinu Další komerční ředidla: příprava podle pokynů výrobce

Stanovení stupně ředění předpoklad: inseminační dávka musí osahovat min 10mil aktivních spermií (Ps) základní hodnoty pro stanovení poměru ředění: hustota spermatu po odběru v miliardách (H) – 1100 mil v cm3 procento aktivních spermií po rozmrazení (A) – 30% objem ejakulátu (V) – 5 cm3 praktický výpočet: objem pejety 0,250 cm3 využitelný objem (ztráta na zátku,vzduch.bublinu) 0,225 cm3 při inseminaci se využije 0,190 cm3  ztráta 15% aby se do plemenice dostalo min 10mil Ps, musí celá dávka obsahovat 12 mil Ps vzorec pro výpočet počtu dávek (Pd): Pd = (V x H x A) / Ps vzorec pro výpočet množství přidávaného ředidla (R) R = 0,225 (využitelný objem pejety) x Pd - V

Postup ředění a plnění pejet odebrané sperma ve sběrači do laboratoře, smyslové posouzení, zvážení do špičky sběrače keramický prútokový korálek, odběr vzorku pro stanovení hustoty zavaření sběrače, nasazení silikonové hadičky a korálek, připnutí na konec nálevky s ředidlem přidávání ředidla ke spermatu na oscilačním stolku, celk. doba ředění cca 10 min (býk), 45 min (kanec), laboratorní teplota do sběrače s naředěným spermatem nasávací hadičky  plnění do pejet automatické plnění: plnění, zatavení, označení, za hod 6-7 tis pejet

Označování pejet CS BJR 255 Bajer .. CZ 386 14964 020596 ISB CZ 04 1.oddíl: kód plemene (max 3 písmena) značka registru (max 3 písmena) číslo registru (max 3 číslice) 2. oddíl: jméno býka (max 24 písmen) IBR status (pozitivní IP, negativní volná místa) 3.oddíl: kód země číslo býka v uchu 4.oddíl: datum odběru spermatu 5. oddíl: kód inseminační stanice

Hluboké chlazení spermatu kryobiologie = biologie nízkých teplot, chování biologických objektů při nízkých teplotách kryokonzervace = uchování bio materiálu při teplotách pod bodem mrazu kryoprotektiva = látky chránící biologický materiál zvyšují počet přežívajících buněk snížení množství ledových krystalů vliv na strukturu vody, zvyšují uspořádanost molekul v přírodě přežívají larvy až –30oC (glycerol dosahuje až 25% hmotnosti celé larvy) glycerol: pro kryokonzervaci pohl. buněk, krve, kostní dřeně přidaný ke spermatu váže volnou vodu zabraňuje krystalizaci důležitá je propustnost buněčné membrány nutné ponechat buňky v prostředí s glycerolem = ekvilibrace

Hluboké chlazení spermatu dimethylsulfoxid: rychleji řřechází přes buněčnou membránu nevýhodou jsou toxické účinky suchý led: poprvé Polge a kol. (Anglie), 1949 ekvilibrace 3-5oC 4-16 hod, 16% glycerinu zmrazování na suchém ledu –79oC v peletách kontaminace směsí mikroorganismů tekutý dusík: Meryman (1966)  anabióza spermií při –130oC, pod –160oC jsou zastaveny rekrystalizační procesy tekutý dusík –196oC 1969 – 1972 zavedení japonské metody v ČR, snížení rizika kontaminace mykoplazmata: 60% ID kontaminováno (pelety), mycoplasma bovigenitalium při –160oC přežívají několik let, eliminace antibiotiky

Postup zmrazování spermatu 20% ejakulátů nevhodných ke zmrazování největší odumírání při 0 až –40oC, kritická teplota v kontejneru –60oC naplnění dutinek, ekvilibrace (= pronikání glycerolu přes cytoplazmatické membrány) průměrně 5 hod, nejméně však 2 hod zmrazování podle křivky řízené počítačem na roštu,páry tekutého dusíku, t -130oC, po vložení stoupne teplota na –70oC (kritická hranice) zmrazování po dobu 9 min  do tekutého dusíku

Uchování zmraženého spermatu Dlouhodobě uchovávané sperma je sperma,které je po speciálním technologickém postupu uchováváno při teplotě –196oC ID v provozních kontejnerech v kelímcích po 24 až 48 hod. od zmražení hodnocení aktivita vyřazení spermatu s aktivitou nižší než 30% a když vyrobené množství pejet přesáhlo max. počet stanovení výpočtem pejety v kelímcích umístěny vatovou zátkou dole

Rozmrazování spermatu rozmrazování bezprostředně před inseminací pejeta do vodní lázně, teplota cca 35oC pejety s obsahem 0,25 cm 3 7 vteřin pejety s obsahem 0,50 cm3 15 vteřin kontrola označení, vzduchová bublinka musí být u zavařeného konce pejety vložení do přenosové aparatury

Lyofilizace odstranění vody sublimací za zmrazeného stavu 1949 Polge – sperma kohouta (30% glycerolu) sperma se zmrazí a vysuší ve vakuu zabrání se hypertonickému prostředí získá se suchý prášek oživení spermií 5-20%