Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Srážecí metody. Srážení  Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu  První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH 4.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Srážecí metody. Srážení  Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu  První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH 4."— Transkript prezentace:

1 Srážecí metody

2 Srážení  Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu  První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH 4 ) 2 SO 4  Filtrace nahrazena centrifugací

3 Rozpustnost bílkoviny  Vlastnostmi bílkoviny – distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny

4 Rozpustnost bílkoviny  Vlastnostmi roztoku – pH, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota

5 Izoelektrická precipitace pI

6 Srážení neutrálními solemi vsolování vysolování

7 Vsolování H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O

8 Vsolování

9 Vysolování

10 Vysolování

11 Praktické aspekty  Hofmeistrova řada Anionty SCN -, J -, ClO 4 -, NO 3 -, Br -, Cl -, Ac -, SO 4 2-, PO 4 3- SCN -, J -, ClO 4 -, NO 3 -, Br -, Cl -, Ac -, SO 4 2-, PO 4 3-Kationty Na +, K +, NH 4 +

12 (NH 4 ) 2 SO 4  Rozpustnost se málo mění s teplotou  Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 )  Levný  Stabilizuje bílkoviny  Relativně čistý

13 Srážecí křivka (NH 4 ) 2 SO % Aktivita bílkovinyKoncentrace bílkoviny

14 Srážení - dvojstupňově

15

16 Přidané množství  Tabulky  Vzorce

17 Přidané množství  Tabulky  Vzorce

18 Provedení El. míchačka Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace pevný (NH 4 ) 2 SO 4 nebo saturovaný roztok (NH 4 ) 2 SO 4 úprava pH NH 4 OH

19 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou  Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O H2OH2O

20 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou

21

22

23 Výběr rozpouštědla  Kompletně mísitelné s vodou  Nereaguje s bílkovinou  Musí mít dobrý precipitační efekt EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

24 Srážení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou  Nutno provádět při T < 0 o C, při větší teplotě dochází k denaturaci  Dvojstupňově  Přídavky z tabulky nebo podle vzorce

25 Srážení org.polymery Princip identický s rozpouštědly  DEAE dextran  PEG  Polyakrylová kyselina  Rivanol  Kaprylová kyselina

26 Srážení selektivní denaturací  Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z % v nativním stavu.  Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla  Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat

27 Tepelná denaturace

28  Doba inkubace je důležitá pouze pro reprodukovatelnost – denaturační křivka se tím posouvá po teplotní ose, má význam pro vyhřívání větších objemů  Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin

29  pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno  Při vyšší teplotě běží více proteolýza

30 pH denaturace  Provádět za definované teploty  Změny pH dělat co nejrychleji  Pro změny pokud možno nepoužívat silné kyseliny a zásady

31 pH 5 HAcpH 8 Tris pH 4 k.mléčnápH 9DEA pH 2H 3 PO 4, H 2 SO 4 pH 11NaOH  Extrémy pH – bílkovina silně ionizovaná a zůstává v rozpuštěném stavu  nutná zpětná úprava pH

32 Denaturace org.rozpouštědly  Pří srážení organickými rozpouštědly – T < 0 o C T < 0 o C  Pří denaturaci organickými rozpouštědly – T = 20 – 30 o C T = 20 – 30 o C  Alkoholy s delšími alifatickými řetězci mají větší denaturační vliv  T a pH musí být přesně definovány EtOH, MetOH, aceton


Stáhnout ppt "Srážecí metody. Srážení  Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu  První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH 4."

Podobné prezentace


Reklamy Google