09_luminiscenČní metody Petr Zbořil

Prezentace na téma: "09_luminiscenČní metody Petr Zbořil"— Transkript prezentace:

1 09_luminiscenČní metody Petr Zbořil
C6200-Biochemické metody 09_luminiscenČní metody Petr Zbořil

2 Luminiscenční pochody
Emise záření Přechod elektronů z excitovaného stavu do základního Způsob dosažení excitovaného stavu Absorpcí fotonu – fotoluminiscence Fluorescence, fosforescence – UV, VIS Radioluminiscence – scintilátory, fosforescence Chemickou reakcí – chemiluminiscence Včetně biochemických - bioluminiscence Radioaktivním rozpadem

3 Luminiscenční spektroskopie
hn k k k k k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

4 Luminiscenční spektroskopie

5 Základní pojmy Excitace a emise Interakce s rozpouštědlem
Singletový excitovaný stav Singletový základní stav

6 Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu Dl F Absorpce Emise nm

7 Základní pojmy l3 l2 l1

8 Základní pojmy Excitovaný stav – střední doba života 10-7 – 10-9 s. O

9 Základní pojmy Kvantový výtěžek fluorescence
= počet kvant emitovaných/počet kvant absorbovaných = ke/(ke + S kk) ke = rychlost emise kk = rychlost konverzních procesů Intenzita fluorescence látky = f (e, F, N)

10 Základní pojmy Doba života excitovaného stavu
Doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu 1/e Io Střední doba života t = 1/ kf If = I0 e – t/ t n- refrakční index rozpouštědla e – molární abs. Koeficient n – vlnočet abs. maxima Přirozená doba života to Definovaná pro F = 1 ∞ t0 = 2, n2.nA2 . ∫ e(n)dn A n

11 Základní pojmy F = t/t0 Střední doba života fluorescence
Fluorescein 4,6 ns Chininsulfát 15 – 40 ns NADH 0,5 ns

12 Biochemicky významné fluorofory

13 Instrumentace

14 Instrumentace Zdroj: Xenonová lampa Rtuťová výbojka Laser
Světelné diody - LED (430, 450, 505, 592, 612 and 637 nm)

15 Instrumentace Monochromátor mřížka filtry

16 Instrumentace

17 Instrumentace RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu

18 Instrumentace Měření střední doby života fluorescence

19 Podmínky fluorescence
Fenolftalein Fluorescein

20 Podmínky fluorescence
Pokles polarity 6 – 1. Závislost na polaritě a viskozitě Nitrobenzoxadiazol

21 Podmínky fluorescence
Závislost fluorescence na teplotě F 80 40 °C

22 Podmínky fluorescence
Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu F 80 40 min

23 Podmínky fluorescence
450 nm 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl Excitace 450 nm 600 nm 1 3 2 3 Emisní spektrum

24 Kvantitativní fluorimetrie
Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = Io F.2,3.ed.c F c

25 Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení koncentrace aminokyselin 390/464 nm (395/475) 340/455 nm 450/550 nm

26 Kvantitativní fluorimetrie
Stanovení bílkovin CBCQA

27 Kvantitativní fluorimetrie
Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng

28 Kvantitativní fluorimetrie
Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid – ds DNA SYBR Green – (ss DNA), RNA rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes

29 Kvantitativní fluorimetrie
SYBR green – asymetrické cyaninové Barvivo Interkaluje přednostně do ds DNA, méně ss DNA , nejménš RNA Absorbuje modré λmax = 497 nm emituje zelené λmax = 520 nm

30 Fluorogenní substráty
Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid

31 Fluorogenní substráty
Peroxidasy – amplex red, vznik resorufinu

32 Fluorogenní substráty
Proteinasy, peptidasy Fluorescenční konjugáty proteinů a peptidů

33 Fluorogenní substráty
Fosfolipasa A

34 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor F H2O H2O Emisní spektrum nm

35 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
substrát F310 t (min)

36 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty OG Karboxyfluorescein – (494/520 nm) CF Absorpce/emise fluoresceinu při pH 9 CF-karboxyfluorescein OG oregon green Oregon Green - (496/524 nm)

37 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Teramethylrhodamin – 545/580 nm) Kumariny – 350/450 nm)

38 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty Dansyl Benzoxadiazol –N-sukcinimid

39 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Fluorescenční konjugáty

40 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
L + M  LM Kd = Lf.Mf/LM Interakce makromolekul s ligandy F Ligand vázaný Ligand volný koncentrace makromolekuly

41 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu Cb,Cf – koncentrace vázaného, volného Ligandu C – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence F = Ff + Fb F = Cf .Ff + Cb. Fb F = (C-Cb) Ff + Cb. Fb F = CFf – CbFf + Cb. Fb F = Fo + Cb (Fb – Ff) Cb = (F – Fo)/ (Fb – Ff)

42 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů Kys. cis-parinarová Fluorescein-PE Anthroyloxypalmitát

43 Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí
Použití značené makromolekuly Fluorescence značené bílkoviny F Koncentrace ligandu

44 Fluorescence a cytochemie
Značení bílkovin, protilátek Značení nukleotidů, primerů

45 Fluoreskující proteiny
GFP 395 (475) – 509 nm Aequorea victoria i jiné 238 AA Fluorofor reakcí 3 AA Lokalizace proteinů Reportér (exprimovaný gen) Mutanty – změna barvy – YFP (T203Y), CFP (Y66W)

46

47 Fluorescenční rezonanční transfer energie (Försterův přenos)
Nezářivý přenos energie z donoru na akceptor (1 – 10 nm)

48 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR F A F nm

49 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm

50 Fluorescenční rezonanční transfer energie
DONOR AKCEPTOR F A F nm

51 Fluorescenční rezonanční transfer energie
Donor Fo F h = 1 – F/Fo A F nm

52 Fluorescenční rezonanční transfer energie
t – doba života exc. stavu J – překryvový integrál n – refraktivní index rozpuštědla n – vlnočet emise donoru = Ro6/(Ro6 + R6) Ro6 = , t.J/n2no2

53 Fluorescenční rezonanční transfer energie
Použití – změření vzdálenosti mezi dvěma molekulami v bílkovině Tryptofan (290/340) vs. NADH (340/450 nm)

54 Fluorescenční rezonanční transfer energie

55 Hybridizační sondy

56 Hybridizační sondy

57 Molekulové majáky

58 Hybridizační sondy

59 Dynamika membrán Fluorescence recovery after photobleaching

60 Dynamika membrán FRAP Rychlost – průběh obnovení Výtěžek (recovery)

61 Fluorescenční anizotropie

62 Fluorescenční anizotropie
Polarizační filtry

63 Fluorescenční anizotropie

64 Fluorescenční anizotropie

65 Fluorescenční anizotropie
Polarizace fluorescence p = Ih – Iv Ih + Iv Fluorescenční anizotropie r = Iv – Ih Iv + 2Ih Rotační relaxační čas t, střední doba života fluorescence r, rotační relaxační čas molekuly ro – anizotropie nepohyblivé molekuly ro/r = 1 + 3t/r excitace a V objem h viskozita r = Vh/RT ro = (3 cos2a -1)/5 ro/r = 1 + 3tRT/Vh

66 Fluorescenční anizotropie
Využití: Interakce makromolekuly s ligandem E – S (K, I), Ag – Ab, hormon - receptor F r mg makromolekuly

67 Fluorescenční anizotropie
Využití: Měření viskozity prostředí ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro/r = 1 + K/h h = 2,4r/(0,362 – r) r Fl. anizotropie DPHT Vázaného v liposomech DPPC °C

68 Fosforescence Multiplicita M = 2S + 1 hn k1 k4 k5 k4 k3
A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

69 Fosforescence Střední doba života t – 100 s

70 Fosforescence Kvantový výtěžek fosforescence fluorescence
FP = k3/(k3 + k2 + k4) Ff = k2/(k3 + k2 + k4) Ff/ FP = k2/k3 fluorescence F fosforescence °K hn k k k k k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k k3 k4 A hn hn

71 Fosforescence Experimentální uspořádání

72 Fosforescence Vzorek Rozpouštědla rigidní skla bez krystalů
(ethanol, metanol, voda:ethylenglykol., atd N2

73 Fosforescence Aplikace fosforescence

74 Fosforescence Fosforescence alkalické fosfatasy
3 Try, pouze Try 109 fosforeskuje 1 – nativní enzym 2 – enzym po odstranění Zn 1 2

75 Chemiluminiscence Při reakci musí vznikat dostatek energie, aby došlo k excitaci elektronů. Proto musí být reakce exotermní a obvykle je to oxidace. Energie se využije pro excitaci elektronů, uvolní-li se jako teplo chemiluminiscence se neobjevuje. Excitovaný produkt musí být schopný ztrácet svoji energii buď ve formě fotonu, nebo ji převádět na fluoreskující sloučeniny. Přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise.

76 Chemiluminiscence Přístrojové vybavení:
od jednoduchých luminometrů až po vysoce automatizované chemiluminiscenční analyzátory, ve kterých se provádí imunochemické reakce s chemiluminiscenční detekcí. Standardní luminometry se do určité míry podobají fluorimetrům. Před měřicí kyvetou ovšem nemají žádný zdroj světla ani filtr. Uspořádání za kyvetou odpovídá fluorimetrům (filtr, fotonásobič). Téměř všechny luminometry mají také nastřikovací zařízení, protože u zábleskové chemiluminiscence je nutné provést měření ihned po nástřiku reagencií. Některé luminometry měří luminiscenci v mikrotitračních destičkách.

77 Chemiluminiscence Jednoduchý luminometr

78 Chemiluminiscence Luminometr na destičky

79 Chemiluminiscence

80 Chemiluminiscence Luminol

81 Chemiluminiscence Luciferin světlušky

82 Chemiluminiscence

83 Chemiluminiscence Aequorin – Aequorea victoria GFP – fluorescence
Aequorin - chemiluminiscence

84 Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
Prostetická skupina - typ luciferinu

85 Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria
Průnik vápníku do mitochondrií Aktivuje oxidaci