Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová."— Transkript prezentace:

1 IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová

2 1) Detekce proteinů a DNA v rakovinných buňkách - fluorescenční barvení 2) Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného) V praktiku budou řešeny dvě úlohy:

3 Úloha 1: Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA aktin: faloidin konjugovaný s fluoroforem TRITC - červený signál DNA: DAPI - modrý signál použité buňky - buněčná linie MCF-7 (rakovinné buňky nádoru prsu) Použité cytostatikum - taxan paclitaxel

4 Fluorescenční barvení - princip Detekovaná molekula Molekula specificky interagující s detekovanou molekulou ve vzorku „neviditelné“ → zviditelnění detekované molekuly Signál produkující molekula fluorofor

5 Fluorescenční barvení - detekce mikrofilament Faloidin jed z houby Amanita phalloides specificky se váže na mikrofilamenta (tzv. F-aktin) a zabraňuje jejich depolymerizaci (mechanismus toxicity) fluorofor TRITC vyzařuje červené světlo po excitaci zeleným světlem

6 METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce mikrofilament F-aktin phalloidin ve vzorku „neviditelné“ → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu TRITC

7 Fluorescenční barvení - detekce DNA DAPI interkaluje se do malého žlábku dsDNA, tato vazba zvyšuje excitační vlastnosti DAPI po excitaci UV světlem vyzařuje modré světlo, volný DAPI svítí mnohem méně - není potřeba promývat

8 Fluorescenční barvení - detekce DNA DNA ve vzorku „neviditelné“ → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu DAPI DNA UV

9 Fixace - první krok přípravy vzorku  brání rozkladu a autolýze tkáně  cíl  zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín)  vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni  rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet

10 Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s konjugátem faloidinu-TRITC odstranění nevázaného faloidinu-TRITC pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

11 Fluorescenční barvení mikrofilament Kontraktilní prstenec

12 Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA Jak se liší mikrofilamenta a jádra v rostoucích a nerostoucích buňkách?

13 Úloha 2: Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE - dnes I. část Vzorky: kuřecí sval, roztok BSA, mléko Izolace proteinů z tkáně: prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk  Chemicky (používáme v našem experimentu)  mechanicky  ultrazvuk

14

15 Izolace proteinů  přenos tkání a poteinů do zkumavky s  dezintegrace buněk a resuspendování proteinů pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát)  oddělení směsi proteinů od nezlyzovaných zbytků centrifugací  pomocí metody podle Bradfordové  použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu pro vytvoření kalibrační křivky Stanovení koncentrace proteinů Pracovní postup:

16 Princip metody Bradfordové  kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordové činidla s roztokem obsahujícím proteiny  Bradfordové činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (ARG, PHE, TRY a PRO)  po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou  detekce při 595 nm

17 Kalibrační křivka

18 Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE  povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS  nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel  separace proteinů pomocí elektroforézy Identifikace proteinů  barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue  lokalizace proteinů v gelu, porovnání hladiny proteinů v jednotlivých vzorcích Příště uvidíte...


Stáhnout ppt "IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová."

Podobné prezentace


Reklamy Google