Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

SLOŽENÍ MÉDIÍ  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Koncentrace.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "SLOŽENÍ MÉDIÍ  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Koncentrace."— Transkript prezentace:

1 SLOŽENÍ MÉDIÍ  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Koncentrace živin v médiu [mmol/l] Živina Knop Hoagland a Snyder Murashige a Skoog Gamborg Shenk a Hildebrandt NO ,9415,0039,4024,72 NH ,612,022,06 celkový N10,9415,0060,0126,7427,32 PO ,841,001,241,082,6 SO ,012,001,502,031,62 Cl - --5,982,042,72 K+K+ 4,306,0020,0424,72 Na ,08- Mg 2+ 1,012,001,501,011,62 Ca 2+ 4,235,002,991,021,35 Hydroponická médiaMédia pro kultivaci in vitro

2 SLOŽENÍ MÉDIÍ pro kultivaci rostlin in vitro a)Makroprvky b)Mikroprvky Nezbytné Prospěšné až nezbytné c) Vitaminy d) Aminokyseliny e) Sacharidy f) Doplňky g) Pufry h) Růstové regulátory i) Zpevňující složky SLOŽENÍ MÉDIÍ

3 a)Makroprvky – N, P, K, Ca, Mg, S Důležitá jak koncentrace, tak vzájemná vyváženost. N NO 3 - NH 4 + N – nejprve jako zdroj N používány NO 3 - ; přidání redukované formy NH 4 + může být prospěšné NO 3 -  NH 4 + energie SLOŽENÍ MÉDIÍ ??? Proč ne jen NH 4 + ??? toxicita při vyšších koncentracích (kompenzovat přídavkem kyselin Krebsova cyklu) příjem vede k poklesu pH  potřeba pufrovat média 2- oxoglutarát Cyklus kyseliny citrónové glutamát glutamin glutamát (2) NH NH 4 +

4   pH NO 3 -  pH NH 4 + Příjem NO 3 -  při  pH, ……………. příjem NH 4 +  při  pH NO 3 - OH - NH 4 + H+H+ NO 3 - OH - NH 4 + H+H+  pH   pH NO 3 - NH 4 + V médiu NO NH 4 + (počáteční pH média 5,4 -5,8) NH 4 + NO 3 -   nejdříve příjem NH 4 +    pH následuje příjem NO 3 -    pH SLOŽENÍ MÉDIÍ

5 b) Mikroprvky – Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo Jsou součástí metabolicky a fyziologicky důležitých proteinů Chelatony - EDTA c) Vitaminy Rostliny jsou schopny vitaminy syntetizovat, rostlinné explantáty často nejsou soběstačné d) Aminokyseliny Okamžitě dostupný zdroj N; rychlejší příjem; organické a anorganické zdroje N nejsou zaměnitelné !!! Hydrolyzát kaseinu Hydrolyzát kaseinu – směs aminokyselin a peptidů glycink. glutamová, glutamin, k. asparagová asparagin Samostatně : glycin, pro některé kultury k. glutamová, glutamin, k. asparagová, asparagin, … ostatní výjimečně B1, B6, kys. nikotinová, (inositol)

6 e)Sacharidy Explantátové kultury nejsou většinou autotrofní  nutnost dodat zdroj C a energie z média SLOŽENÍ MÉDIÍ ?? ?? Navození autotrofie v podmínkách in vitro – typ kultury vynechání sacharidu z média zvýšení koncentrace CO 2 (  konc. CO 2 v okolí nádob, propustné uzávěry kultivačních nádob) zvýšení ozářenosti, spektrum použitého světla Zdroj C a energie  Zdroj C a energie ?? ?? Vliv sacharidů v médiu na schopnost kultury fotosyntetizovat Heterotrofní kultury – plně závislé na vnějším zdroji C Mixotrofní kultury – fotosyntetizující + zásobované z média ?? ?? Mixotrofie X úspěšnost přenosu do ex vitro podmínek

7 ?? ?? Jaký sacharid a v jaké koncentraci sacharóza Nejčastěji: sacharóza 1-3 % - floémem transportovatelný sacharid u všech rostlin glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, manitol, Dále: glukóza, maltóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza, manitol, sorbitol, rafinóza sorbitol, rafinóza.. Požadavky se mohou velmi lišit v závislosti na rostlinném druhu i typu kultury a jejím vývoji Využitelnost sacharidu závisí na schopnosti kultury :  transportovat daný sacharid (z buňky do buňky x vodivými pletivy)  rozkládat daný sacharid vně buněk (sacharóza  glukóza + fruktóza, rafinóza  ? fruktóza + melibióza nebo sacharóza + galaktóza)  přijímat daný sacharid (pasivní transport X aktivní transport)  utilizovat daný sacharid (např. manitol, sorbitol, RFO) ! Výběr vhodného sacharidu často na základě empirického přístupu Př: Př: Listové disky Capsicum annum  tvorba výhonů - glukóza Př: Př: kultury izolovaných kořenů pšenice (a dalších jednoděložných) – glukóza Př: Př: některé orchideje - fruktóza Př: Př: kalus fazolu, somatická embrya jedle - maltóza Př: Př: Rosaceae – sorbitol, jasan, celer, oliva – manitol Př: Př: embryogenese u citrusů - galaktóza Př: Př: kalus okurky - rafinóza SLOŽENÍ MÉDIÍ

8 Osmotikum  Osmotikum Přítomnost sacharidu v médiu snižuje osmotický potenciál média  osmotický stres (morfogenní signál) Př: Somatická embryogeneze jehličnanů – pozitivní vliv vysokých koncentrací sacharózy lze nahradit osmotickým stresem vyvolaným manitolem SLOŽENÍ MÉDIÍ Přítomnost sacharidu v buňkách  osmotické přizpůsobení (zachování transpotru vody při osmotickém stresu)  osmoprotekce (ochrana membrán a makromolekul při nedostatku vody) Osmoprotektant  Osmoprotektant Signální molekula  Signální molekula  přímé působení sacharidu  signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry  hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace ? apoplastická invertáza invertáza x SuSy  obsah sacharidů se promítá do hladiny sacharidu se signálním potenciálem (trehalóza-6-P) nebo jiné signální molekuly (SnRK1)  přímé působení sacharidu  signál generován transportérem ? - rozhoduje míra transportu přes membránu sacharózové transportéry ( X jiné systémy vázané na membráně) hexózové transportéry  hexokinázový systém – rozhoduje „rychlost“ fosforylace ? apoplastická invertáza invertáza x SuSy  Cukr může indukovat změny hladin fytohormonů (auxinů a cytokininů)

9 h) Růstové regulátory Funkce nikoli nutriční, ale regulační Účinné ve velmi nízkých koncentracích. Ovlivňují současně velký počet rozdílných procesů. Nejdůležitější in vitro : auxiny, cytokininy, kys. abscisová, gibereliny SLOŽENÍ MÉDIÍ f) Doplňky Dodávají báze NK, NK, aminokyseliny, vitaminy, růstové regulátory … Extrakty : bramborový, kvasničný extrakt Tekuté endospermy: rajčatová šťáva, banánová šťáva, nejčastěji… kokosové mléko g) pH média- Pufry Stabilizace pH médií užitím organických pufrů pH ovlivňuje rozpustnost solí pH ovlivňuje příjem látek z média (živin i hormonů) pH ovlivňuje gelační schopnosti agaru (pod pH 5 nedostatečná gelace)

10 SLOŽENÍ MÉDIÍ auxin cytokinin Tvorba kořenů na řízcích Embryogeneze Tvorba adventivních kořenů v kalusu Tvorba adventivních výhonů Proliferace úžlabních výhonů Iniciace kalusu Auxin cytokininový model Auxin cytokininový model - tabák, Skoog a Miller, 1957 Rozhoduje:  endogenní hladina růstových regulátorů, která je výsledkem interakce endogenních hladin fytohormonů a exogenní aplikace růstových regulátorů.  volba vhodného fytohormonu a nebo růstového regulátoru s obdobným účinkem

11 Habituace =tkáňová kultura po opakovaných pasážích ztrácí závislost na exogenním cytokininu ztrácí závislost na exogenním cytokininu cytokinin auxin Iniciace kalusu Habituace je mitoticky přenosná vlastnost syntézy cytokininů ? reverzibilní  epigenetická komplexní změna ? mechanismus habituace ? exprese cytokininového receptoru CRE 1 exprese genů účastnících se cytokininové signalizace exprese receptorů AHK3, AHK2 Analýza transkriptomu u Arabidopsis up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů, DNA- a chromatin modifikujících enzymů… up-regulace transkripčních faktorů, transposonům příbuzných elementů, DNA- a chromatin modifikujících enzymů… změna asi 800 genů  Pravděpodobně NE SLOŽENÍ MÉDIÍ

12 ABA  snižuje transpiraci během aklimatizace rostlin ex vitro  zvyšuje stresovou toleranci  zvyšuje frekvenci přežívajících explantátů po kryoprezervaci  zpomaluje růst udržovacích kultur  zlepšení kvality somatických embryí  zabránění předčasnému klíčení somatických embryí  navození klidového stádia při přípravě umělých semen  regulace syntézy zásobních látek v embryích  zvýšení desikační tolerance  synchronizace somatické embryogeneze Rai et al., 2011

13 SLOŽENÍ MÉDIÍ Interakce:X Interakce: minerální výživa X růstové regulátory ??? ??? optimální obsah minerálních složek média; ??? ??? mohou minerální živiny částečně nahradit roli R.R. ??? ??? mohou R.R. kompenzovat disbalanci v minerální výživě N Rozhoduje hlavně N a jeho forma : HN 4 NO 3 Poměr HN 4 + : NO 3 - má vliv na : dediferenciaci růst morfogenezi N:cukr Důležitý také poměr N:cukr NIAA  N   IAA N ABAGA  N   ABA   GA Př: Kořenění segmentů Cizrna WH +IBA 70 % zakořeněných segmentů WH +  20 % -,,- ½ WH +IBA 47 % zakořeněných segmentů ½ WH +  46 % -,,- N  N   cytokinin N  N   etylén

14 SLOŽENÍ MÉDIÍ i) Zpevňující složka agar (agaróza) Nejčastěji : agar (agaróza) Tvoří gel, taje při 100 °C a tuhne při  45 °C; není tráven rostlinnými enzymy, nereaguje se složkami médií ( ?? inertní ) XX Tekutá média – prámky, můstky, zavěšené kapky, „temporary immersion systems“. Př: Kořenění segmentů: Leucopogon (extrém)  soli +  R.R 70 % zakořeněných segmentů MS + NAA 38 % -,,- Př: Produkce adventivních výhonů: Jalovec MS + BA + NAA 9 % segmentů tvořících výhony HS + BA 18 % -,,- Př: Produkce somatických embryí : Jasan MS + BA + NAA 17 % explantátů tvořících SE DKW +  20 % -,,-

15

16 ASEPTICKÁ KULTIVACE  Sterilizace výchozího materiálu  Sterilizace médií, nástrojů  Detekce kontaminace  Citlivost kontaminujících organismů  Použití antibiotik Sterilizace výchozího materiálu  Sterilizace výchozího materiálu Omytí ředěným roztokem detergentu Omytí tekoucí vodou Ošetření sterilizačním činidlem : NaClO, Ca(ClO) 2 AgNO 3, H 2 O 2, HgCl 2, EtOH kontakt činidlo-sterilizovaný materiál (EtOH, smáčedlo, snížený tlak, míchání) trvání sterilizace – krátké  nedostatečná sterilizace dlouhé  poškození rostlinných pletiv koncentrace sterilizačního roztoku, vysoká X nízká Závěrečné omytí sterilní vodou ASEPTICKÁ KULTIVACE  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin

17 ASEPTICKÁ KULTIVACE Sterilizace je úspěšná při co nejnižší výchozí hladině kontaminace části rostlin ve styku s půdou - silně kontaminovány důležitý je výběr explantátu rostliny rostoucí za nízké rel. vlhkosti a nezalévané na list – málo kontaminovány kontaminace se mění výrazně v závislosti na ročním období úspěch jen když vnitřní pletiva jsou prosta kontaminace Sterilizace médií, nástrojů  Sterilizace médií, nástrojů autoklávování – 120 °C; 0,1 MPa, doba sterilizace závisí na objemu média. ( pokles pH o 0,3-0,5 ) filtrace – skleněné frity, membránové filtry suché teplo – 3h 150 °C  - radiace, páry kys. peroctové 

18 ASEPTICKÁ KULTIVACE Detekce kontaminace  Detekce kontaminace viditelný růst latentní kontaminace  zpomalený růst, špatné zakořeňování, náhlý úhyn rostlin po mnoha subkultivacích  kontaminace napadá pletiva, snižuje pH, vyčerpává živiny, produkuje fytotoxické látky detekce – přeočkování na různé půdy - někdy lze detekovat jen sérologicky nebo e- mikroskopií většina kontaminací nepřečká běžné sterilizační postupy Citlivost kontaminujících organismů  Citlivost kontaminujících organismů ale !! Někdy velká odolnost: rod Bacillus : 5 min ponoření do EtOH, opálení lihovým kahanem, ale i 1 týden v EtOH, i 20 min při 110 °C, výjimečně 20 min při 120 °C. Použití antibiotik  Použití antibiotik nemají nahradit pečlivost aseptické práce ! některá antibiotika podporují růst častěji – fytotoxicita - antibiotika, která interferují se syntézou DNA, RNA působí i na eukaryota; výhodné pokud specificky působí na mikroorganismy nejlépe znát citlivost kontaminujícího mikroorganismu antibiotika působí na aktivně rostoucí organismy rezistence

19 TYP EXPLANTÁTU Genotyp Genotyp:Dvouděložné Jednoděložné Nahosemenné Nejlépe reagují: Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, BrassicaceaeStáří:a) stáří jedince „skutečné stáří“--- počet dní od vyklíčení rostliny „fyziologické stáří“----fáze růstu a vývoje rostliny c) u již založené kultury in vitro rozhoduje subkultivační interval b) relativní stáří pletiva (hodnocení velmi obtížné např.: Vzrostný vrchol z 50 let staré rostliny v juvenilním stavu je „ mladý“. U dřevin nejlepší výsledky s výhony u báze kmene)  Většinou nejvhodnější explantát z nově založených orgánů  Méně často - z plně vyvinutých orgánů  V některých případech jen změna postupu morfogeneze: explantát z mladých listů nejprve koření z dospělých listů nejprve tvoří pupeny  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin

20 Velikost explantátu třeba zvolit optimální !! vhodné umístění vzhledem k médiu, zachovaná polarita včetně směru transportu látek -- příliš malý explantát  velké hynutí, ---- malé zásoby živin, hormonů,  poměr poraněná : neporaněná část povrchu,  produkce etylénu -- příliš velký explantát  špatná manipulace, horší styk s médiem, malý množitelský efekt Polarita explantátu

21 OŠETŘENÍ MATEŘSKÝCH ROSTLIN Dormance: většinou aktivně rostoucí, ne vždy ! Př: Př: tvorba náhradních pupenů na kořen. řízcích dřevin --- jen z dormantních rostlin Stav rostlin: zdravé, aktivně rostoucí, bez stresu, dostatek živin Termín odběru: změny v teplotě, fotoperiodě, osvětlení  hladiny cukrů, proteinů, R.R Působení teploty: teplota při kultivaci mateřské rostliny ovlivňuje chování explantátu Př: Př: % vytvořených pupenů slivoně je úměrné době udržování mat.r. při 4°C Působení světla: promítá se do hladin zásobních látek, R.R.  změny v chování explantátu Působení R.R: ovlivňuje jak růst, tak morfogenezi Př: Př: rajče, ošetření chlormequatem (inhibice syntézy giberelinů)  zvýšení tvorby pupenů na listových explantátech  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Typ explantátu  Ošetření mateřských rostlin


Stáhnout ppt "SLOŽENÍ MÉDIÍ  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Koncentrace."

Podobné prezentace


Reklamy Google