Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

C6200-Biochemické metody 11A_NMR a EPR Petr Zbořil.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "C6200-Biochemické metody 11A_NMR a EPR Petr Zbořil."— Transkript prezentace:

1 C6200-Biochemické metody 11A_NMR a EPR Petr Zbořil

2 Nukleární magnetická rezonance Jádra vykazující nenulový jaderný spin (závisí na počtu protonů a neutronů) se orientují v externím magnetickém poli. Spin může nabývat několika orientací v závislosti na své hodnotě: Počet = 2I + 1, kde I je spinové kvantové číslo o hodnotách 0, ½, 1 …. Hodnoty  I – 1  -3/2, -1, -1/2. 0, ½, 1, 3/2 …

3 Nukleární magnetická rezonance

4 Velikost magnetického momentu M, gyromagnetický poměr γ, jaderný magneton μ, Planckova konstanta (Ћ = h/2Π) a rozlišovací faktor g I a hmotnost jádra m a jeho náboj e jsou ve vztahu M = γ.Ћ.√I(I+1)γ = μ.g I / Ћμ = e. Ћ/2m A ten určuje energii jednotlivých orientací v magnetickém poli intensity B o E I = - M z. B 0 + E 0 M z = γ.Ћ.m I Kde magnetické kvantové číslo m I ≡ I, (I-1)... –(I-1), -I, počet 2I+1 Pro I = ½, m I = ± ½ a energetický rozdíl mezi jednotlivými stavy (orientacemi vektoru spinu) je ∆E = μ.g I.B 0

5 Nukleární magnetická rezonance Magnetický moment rotujícího jádra   =  h/2  gyromagnetický poměr Umístění rotujícího magnetu v elektrickém poli Frekvence rotace: o =  Bo Bo – indukce magnetického pole Larmorova frekvence H – 200 MHz pro 4,7 T atd. Označení přístrojů – 200, 300, atd.

6 Nukleární magnetická rezonance Rozdíl mezi dvěma energetickými hladinami  E =  h B o = h o pokud působíme elm. polem o frekvenci    Dojde k rezonanci a přechodu na vyšší Hladinu o =  Bo Bo M B1B1

7 Nukleární magnetická rezonance (B = 2,3 T) JádroI o (MHz) citlivost% zastoupení 1H½100199,9 13C½250, N1100,0010,36 19F½940, P½400, O5/2130,0030,04

8 Nukleární magnetická rezonance Spin-mřížková relaxace Jádro v excitovaném stavu se zbavuje energie relaxací Relaxační čas (střední doba života jader v excitovaném stavu) – T = – 10 2 s

9 Nukleární magnetická rezonance Stínění jádra – chemické posuny H+H+ H B = B 0 –  B 0  B 0 ) / B 0 (x 10 6 )  = 10 –   chemický posun (ppm)

10 Chemický posun

11 Stínění a chemický posun

12 Standart pro 1 H-NMR Tetrametylsilan - jediná 1 H linie snadno rozpoznatelná - singletový signál nejvíce vpravo - přidává se přímo k vzorku - po skončení měření ho lze mírným zahřátím ze vzorku odstranit

13 Nukleární magnetická rezonance Chemické posuny CH31 CH21,5 R2NH0,5-2 RNH21,5 ArCH32,5 -C=CH3 Ar-NH23,5 – 4,5 X-CH32,5 – 3,5 R-O-CH34 =C=CH25 ArH7-8 RCOH10 RCOOH10-12

14 Nukleární magnetická rezonance Multiplicita signálu – spin-spinová interakce Multiplicita = n+1 (x + 1) n

15 Nukleární magnetická rezonance

16 Přístrojové vybavení Bo B1 VF D

17 Využití NMR Struktura a její změny chemický posun δ – chemické okolí jádra, typ skupiny Multiplicity a interakční konstanty J - počet sousedních mag. aktivních jader a geom. uspořádání Integrální intenzity signálů - počet ekvivalentních atomů v molekule Korelační signály atp.

18 Nukleární magnetická rezonance Supravodivý magnet 7 T

19 Nukleární magnetická rezonance Vzorek – homogenizace pole

20 Nukleární magnetická rezonance Volba přístroje Atomy: 1,89 2,00 2,08

21 Nukleární magnetická rezonance Magnetické pole Energie VF záření Absorpce Metoda continuous wave (CW) – konstantní frekvence – mění se Bo

22 Nukleární magnetická rezonance Magnetické pole Frekvence Energie VF záření Absorpce Metoda continuous wave (CW) – konstantní Bo – mění se frekvence

23 Nukleární magnetická rezonance Fourrierova transformace

24 Nukleární magnetická rezonance Rozpouštědla – Deuterovaná Acetone CD 3 COCD 3 Chloroform CDCl 3 Methylnitrile CD 3 CN Water D 2 O Diethylether (DEE) (CD 3 CD 2 ) 2 O Dimethyl Sulfoxide (DMSO) CD 3 SOCD 3 Ethanol CD 3 CD 2 OD Atd.

25 Nukleární magnetická rezonance Signal-to noise ratio Nízká a vysoká koncentrace

26 Nukleární magnetická rezonance

27

28

29 Nukleární magnetická rezonance- 13 C Carbon-13Chemical Shifts Carbon-13* Environment Chemical Shift Range (ppm) CH3CH C=C--C=C =C-X C6H6C6H6 65 CHCl CHCl (cis)71 Ar CCl 4 97 COOR170 COH210 RCOR220

30 Nukleární magnetická rezonance- 13 C Spin-spinová interakce mezi 13 C- 1 H  Spektrum CH 3 I

31 Nukleární magnetická rezonance- 15 N Nitrogen-14 Chemical Shifts Nitrogen-14* Environment Chemical Shift Range (ppm) NO 2 Na -355 NO 3 - (aqueous) -115 N 2 (liquid) -101 pyridine-93 bare nucleus0 CH 3 CN 25 CH 3 CONH 2 (aqueous) 152 NH 4 + (aqueous) 245 NH 3 (liquid) 266

32 Nukleární magnetická rezonance- 31 P Phosphorous-31 Chemical Shifts Phosphorous-31 Environment Chemical Shift Range (ppm) PBr (C 2 H 5 O) 3 P -137 PF % phosphoric acid0 PCl 5 80 PH P4P4 450

33 Nukleární magnetická rezonance- 31 P

34

35 Měření intracelulárního pH Pomocí posunu signálu 31P

36 Nukleární magnetická rezonance- 31 P Měření koncentrace nukleotidů Pomocí 31P

37 Nukleární magnetická rezonance- 13 C

38 Nukleární magnetická rezonance – 15 N Asimilace amoniaku sledovaná pomocí 15 N Hlíva ústřičná Extrakt mycelia narostlého na 15 NH 4 Cl Mycelium 1 hod. po přidání 15 NH 4 Cl

39 EPR - ESR Zde výtah pro základní pochopení Pro zájemce o bližší seznámení ex.htm

40 EPR – elektronová spinová rezonance B=0 E B EE Rezonanční pole m s = -1/2, paralelní s polem m s = +1/2, antiparalelní Nepárový elektron – nenulový spin – /S/ = 1/2 Orientace – + -, energetické stavy

41 EPR – elektronová spinová rezonance

42  E = h = g  B o  E rozdíl energií h – Planckova konstanta – frekvence mikrovln g – Landéův faktor spin-orbitální interakce  – Bohrův magneton B o – magnetická indukce Počet jader v jednotlivých orientacích Intenzita signálu N 1 /N 2 = e -  E/kT B o = 0,1 – 0,5 T; = GHz

43 EPR – elektronová spinová rezonance Absorpce fotonů – MW oblast  f (B 0 ) změna  nebo B 0 – častější spektrum základní derivace – standartně

44 EPR – elektronová spinová rezonance I Bo dI/dB Bo

45 EPR – elektronová spinová rezonance Interakce s protony – štěpení píků 1 proton I = ½ multiplicita = n (protonů ev. 2nI jádra) + 1, intenzita píků (x + 1) n platí pro ekvivalentní jádra (jinak složitější) n = 1 – 1:1 n = 2 – 1:2:1 n = 3 – 1:3:3:1

46

47 EPR – elektronová spinová rezonance Využití v biochemii - Studium radikálů (peroxidy) - Studium konformace – spinové značky – stabilní radikály - Studium hemu

48 EPR - schema

49 EPR - měření

50 EPR – elektronová spinová rezonance

51 EPR spektrum NADH-UQ reduktasy signál UQ Signál 2Fe2S potlačen, Signál FMN radikálu interferuje

52 EPR – elektronová spinová rezonance EPR spektrum ferredoxinu z mořské řasy (3Fe-4S)1+/0 Typický signál

53 EPR – elektronová spinová rezonance EPR spektrum cyt bc1 – mutant M183K, M183H Fe3+ hem (3,78 = cyt bL 3,44, cyt bH, 2,94 bis-His cyt b nebo c1)

54 EPR – elektronová spinová rezonance EPR spektrum oxidace radikálů LDL vyvolaných H2O2 Spektrum radikálu tokoferolu (A)


Stáhnout ppt "C6200-Biochemické metody 11A_NMR a EPR Petr Zbořil."

Podobné prezentace


Reklamy Google