Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Histologické a (imuno)histochemické metody.  histologie je nauka o mikroskopické skladb ě organismu  zkoumá skladbu t ě la živočišného i rostlinného,

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Histologické a (imuno)histochemické metody.  histologie je nauka o mikroskopické skladb ě organismu  zkoumá skladbu t ě la živočišného i rostlinného,"— Transkript prezentace:

1 Histologické a (imuno)histochemické metody

2  histologie je nauka o mikroskopické skladb ě organismu  zkoumá skladbu t ě la živočišného i rostlinného, d ů ležitá v humánní medicín ě  histologický preparát zhotovený r ů znými histologickými technikami  tenké ř ezy  mikrotom  barvení  nejb ě žn ě jší formou histologického preparátu je tenký ř ez určitým organismem, orgánem, tkání, obarvený n ě kterou z metod histologické techniky a uložený mezi podložním a krycím sklíčkem

3 Rozd ě lení  Cytologie – nauka o skladb ě bu ň ky  Histologie – v užším slova smyslu, nauka o skladb ě tkání  Mikroskopická anatomie – nauka o mikroskopické skladb ě orgán ů

4 Cytologický preparát Mattesia dispora Leidyana ephestiae Hepatozoon sp. Trypanosoma equiperdum

5 Histologický preparát Cryptosporidium fragile v žaludku ropuchy žaludek ropuchy

6 Zpracování tkání - histologie  Odb ě r  Fixace  Krájení tkán ě prosycené parafínem nebo prysky ř icí tkán ě prosycené parafínem nebo prysky ř icí zmrzlé tkán ě zmrzlé tkán ě  Barvení

7 Odb ě r  Biopsie Punkce Punkce Excize Excize Kyretáž Kyretáž Peroperační biopsie Peroperační biopsie  Nekropsie  Postup: Odd ě lení vzorku - velikost tká ň ového bločku max. 1cm 2 Odd ě lení vzorku - velikost tká ň ového bločku max. 1cm 2 Opláchnutí ve fyziologickém roztoku Opláchnutí ve fyziologickém roztoku Vložení do fixační tekutiny - ihned po odb ě ru !!! Vložení do fixační tekutiny - ihned po odb ě ru !!! Označení vzorku Označení vzorku

8 Fixace  rychlá a šetrná denaturace bílkovin bránící autolýze tkání tkání  podmínky fixace rychlost - odb ě r, pr ů nik, velikost vzorku (1cm 2, 1mm 2 ) rychlost - odb ě r, pr ů nik, velikost vzorku (1cm 2, 1mm 2 ) zachování struktury zachování struktury barvitelnost barvitelnost  fixace fyzikální  fixace chemická

9 Fixační tekutiny  formaldehyd (4% formaldehyd, neutrální nebo pufrovaný)  Bouinova (formaldehyd + k. pikrová)  Zenkerova (dvojchroman draselný, sublimát, formaldehyd)  metacarn (formaldehyd, metanol, voda)  Davidson (glycerol,formaldehyd,etanol, voda)  AFA (ethanol, formaldehyd, kyselina octová ledová)  oxid osmičelý, glutaraldehyd

10 Parafínové ř ezy Odvodn ě ní - vzestupná etanolová ř ada Odvodn ě ní - vzestupná etanolová ř ada Projasn ě ní - xylen Projasn ě ní - xylen Prosycení parafínem Prosycení parafínem Zalití do parafínu Zalití do parafínu Krájení na mikrotomu (tlouš ť ka ř ezu 4-10 μ m) Krájení na mikrotomu (tlouš ť ka ř ezu 4-10 μ m)  Rotační x sá ň kový mikrotom Napínání a lepení ř ez ů na podložní skla Napínání a lepení ř ez ů na podložní skla

11 Prosycení parafinem

12 Výhody a nevýhody parafinových řezů Poměrně tenké řezy, které lze barvit téměř všemi metodami Uchovávání nakrájených řezů na sklíčku a zbytku zalité tkáně v parafinovém bloku neomezenou dobu možnost kdykoliv nakrájet další řezy a doplnit barvení možnost kdykoliv nakrájet další řezy a doplnit barvení Alkoholová řada i zalití do parafinu ničí enzymy a způsobuje vyluhování tuků Odvodňováním může dojít ke smrštění tkáně a vzniku artefaktů

13 Rotačnímikrotom

14 Barvení parafínových ř ez ů HE Odparafinování – xylen I, xylen II, 100% alk., 96% alk., 70% alk., voda Odparafinování – xylen I, xylen II, 100% alk., 96% alk., 70% alk., voda Barvení hematoxylinem Barvení hematoxylinem Praní v tekoucí vod ě do zfialov ě ní Praní v tekoucí vod ě do zfialov ě ní Barvení eosinem Barvení eosinem Oplach ve vod ě –odstran ě ní p ř ebytečného barviva Oplach ve vod ě –odstran ě ní p ř ebytečného barviva Odvodn ě ní vzestupnou alkoholovou ř adou Odvodn ě ní vzestupnou alkoholovou ř adou Projasn ě ní Projasn ě ní Montování do kanadského balzámu nebo Damary Montování do kanadského balzámu nebo Damary

15 Hematoxylin-eosin svalovina larvy Galleria melonella senzila larvy Galleria melonella P ř i barvení HE jsou jádra bun ě k modrá hematoxylinem a cytoplasma r ů žová eozinem

16 Masson ů v trichrom Modrý Kolagenní vlákna ve tkáni modrá tegument a svalovina larvy G. melonella tegument larvy G. melonella

17 Masson ů v trichrom Zelený Kolagenní vlákna zelená Elastická vlákna fialová senzyla larvy G. melonella svalovina larvy G. melonella

18 Hematoxylin jádra modrá - Best ů v karmin glykogen purpurov ě červený Gregarina garnhami v caecu sarančete

19 Polotenké řezy Zalévání do pryskyřice (Spurr – podle autora) Fixace glutaraldehydem nebo osmiem Odvodnění alkoholová řada + aceton Pryskyřice polymeruje při 60°C Krájení na tzv. polotenké řezy (500nm – 2 µm) Barvení - toluidinová modř Nepřikrývají se krycím sklem Po kontrole na světelném mikroskopu se ze vzorku vybere místo, které je zajímavé a ze kterého se budou krájet ultratenké řezy pro transmisní elektronovou mikroskopii Ř ez hlavou Eudiplozoon nipponicum

20 Krájení zmrazených tkání  Zmrazovací mikrotom, kryostat  Použití: Imunohistochemie Imunohistochemie Barvení tuk ů Barvení tuk ů Pr ů kaz enzym ů Pr ů kaz enzym ů Peroperační biopsie Peroperační biopsie

21

22 Výhody a nevýhody zmrazených řezů Rychlé zhotovení Uchování enzymů a tuků pro jejich průkaz (histochemie) Řezy jsou hodně silné Nelze uchovávat nezpracované tkáně k dalšímu dokrájení

23 Průkaz melaninu (pigment ve vnější kostře hmyzu) (Lillie’s ferric-ferricyanide melanin staining method with or without acetocarmine counterstain) larva G. melonella parazitovaná kuklicí

24 Značeníafluorescenčnímikroskopie Gregarina polymorpha Mattesia dispora


Stáhnout ppt "Histologické a (imuno)histochemické metody.  histologie je nauka o mikroskopické skladb ě organismu  zkoumá skladbu t ě la živočišného i rostlinného,"

Podobné prezentace


Reklamy Google