Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Mutace vedoucí k farmakogenetickým chorobám Příklad: maligní hypertermie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Mutace vedoucí k farmakogenetickým chorobám Příklad: maligní hypertermie."— Transkript prezentace:

1 Mutace vedoucí k farmakogenetickým chorobám Příklad: maligní hypertermie

2 Farmakogenetika speciální oblast biochemické genetiky, která pojednává o variabilitě odpovědi na léky (..ale i jiné chem. látky) způsobené genetickou variabilitou speciální oblast biochemické genetiky, která pojednává o variabilitě odpovědi na léky (..ale i jiné chem. látky) způsobené genetickou variabilitou genetická variabilita, která mění schopnost organismu absorbovat, transportovat, metabolizovat či vylučovat léky (chem. látky) nebo jejich metabolity genetická variabilita, která mění schopnost organismu absorbovat, transportovat, metabolizovat či vylučovat léky (chem. látky) nebo jejich metabolity polymorfizmus pro lékovou odpověď polymorfizmus pro lékovou odpověď (6,7 % - nežádoucí reakce na léky) (6,7 % - nežádoucí reakce na léky)

3 Maligní hypertermie AD porucha, u které se může vyskytnout dramatická nežádoucí reakce na aplikaci všech běžně používaných inhalačních anestetik (např. halothanu) a myorelaxancií AD porucha, u které se může vyskytnout dramatická nežádoucí reakce na aplikaci všech běžně používaných inhalačních anestetik (např. halothanu) a myorelaxancií vznik vysoké horečky, přetrvávající svalová kontrakce, vystupňovaný katabolismus vznik vysoké horečky, přetrvávající svalová kontrakce, vystupňovaný katabolismus příčina smrti při anestézii (zejména u dětí) – mortalita 10 – 20 % příčina smrti při anestézii (zejména u dětí) – mortalita 10 – 20 % incidence 1 : u dětí incidence 1 : u dětí 1 : u dospělých 1 : u dospělých

4 Svalová buňka dějiště primární abnormality při MH stoupající a klesající množství kalcia způsobuje svalové kontrakce a relaxace rozhodující význam pro homeostázu kalcia - ryanodinový receptor - kalciový releasing kanál na sarkoplasmatickém retikulu kontrakce svalu uvolnění Ca 2+ do myoplasmy relaxace svalu resorbce Ca 2+ do ER ATPdependentní MH – porucha kalciového metabolismu příčně pruhovaného svalstva !!!

5 Snímek z elektronového mikroskopu zachycující spojení endoplasmatického retikula a T-tubulu ukazuje polohu ryanodinového receptoru RYR1

6 Podstata onemocnění MH Za hlavní příčinu je považována porucha funkce ryanodinového receptoru RYR1 sval se změněnou funkcí RYR1 vnímavý sval při kontaktu s triggersubstancí vzniká nekontrolované uvolňování Ca 2+ ze SR s poruchou jeho zpětného vychytávání Konfokálně nasnímaný obraz nahromadění Ca 2+ (zelená a žlutá barva) v cytosolu svalové buňky za 1s (bílá čára) během jednoho akčního potenciálu. R. Corado

7 „ Triggersubstance“ (spouštěče) - substance vyvolávající u MHS pacientů rozvoj MH - krize Látky běžně užívané k úvodu a vedení celkové anestezie: volatilní čili prchavá anestetika - všechny halogenové uhlovodíky jako halotan, isofluran, desfluran, sevofluran depolarizující svalová relaxancia - zejména sukcinylcholin

8 MH episoda Triggersubstance volatilní anestetika depolarizující svalová relaxancia MHS (MH susceptible) pacient

9 Kontakt vnímavého svalu (tj. se změněnou funkcí RYR1) s triggersubstancí Indikuje masivní a nekontrolované uvolňování Ca 2+ ze SR spojené s poruchou jeho zpětného vychytávání Vlna depolarizace z nervosvalové ploténky vyvolá drobný únik Ca 2+ z TT Zvýšená intacelulární koncetrace Ca 2+ Zvýrazněná a dlouhotrvající interakce kontraktilních proteinů svalového vlákna aktinu a myozinu bez následné relaxace

10 Nastává protahovaná svalová kontrakce Dramatický vzrůst aerobního, později anaerobního metabolismu extrémní nároky na kyslík nadprodukce CO 2 nadprodukce tepla zvýšená teplota svalu znamená nižší potřebu Ca 2+ pro reakci aktinu a myosinu toxická koncentrace Ca 2+ brzdí oxidativní fosforylaci v mitochondriích tzn. tvorbu ATP potřebnou pro resorpci Ca 2+

11 Kauzální terapie MH Dantrolen působí na úrovni dyhydropyrimidinového receptoru pravděpodobně zde blokuje přenos membránového potenciálu tlumí tak uvolňování Ca 2+ ze SR neovlivňuje zpětné vstřebávání Ca 2+ Jeho zavedení přispělo ke snížení mortality při MH – krizi ze % (konec 70.let) na 5-10%. Schválen 1979

12 Diagnostika MH In vitro kontrakční test Molekulárně genetická diagnostika

13 Diagnostika MH In vitro kontrakční test vzorek svalové tkáně získané otevřenou biopsií vystaven působení klasických spouštěčů halotanu a kofeinu ve stoupajících koncetracích měřena velikost kontrakce svalového vlákna sval s dispozicí k MH se kontrahuje zřetelně více a při nižších koncentracích než zdravý sval specifita 94%

14 Diagnostika MH Molekulárně genetická diagnostika – mutační analýza genu RYR1 diskordance mezi MH susceptibilitou and RYR1 mutacemi potřeba nezávislého biochemického důkazu, že kandidátní MH mutace je patogenní nízká incidence každé RYR1 mutace rozsáhlost RYR1 genu Komplikace:

15 - lokalizace: 19q exonů - cDNA bp RYR1 gen Exprese RYR1 genu v lidských tkáních

16 RYR1 gen a protein, lokalizace MH mutací RYR1 gen a protein, lokalizace MH mutací 5´ ´ EXONS RYR1 gene A2350T G2434R R2435H R2435L COOH NH 2 Myoplasmatic RYR1 domain Transmembrane / lumenal RYR1 domain RYR1 protein C35R T2206M T2206R R2452W R2454C R2454H R2458C R2458H R2163C R2163PR 2163H V2168M R614C R614L R163 G248R I403M R471C Y522S R533H R552W L4793P Y4796C R4825C T4826I R4861H G4891R G341R MH/CCD region 1MH/CCD region 2MH/CCD region 3 R4893W I4898T G4899R G4899Q A4906V R4914G

17 Mutace v RYR1 genu více než 50% MH rodin a většina CCD rodin detekováno 45 mutací - 41nukleotidových substitucí - 4 malé delece jsou nahromaděny ve třech regionech genu RYR1 : MH/CCD region 1 : N-terminalní AK MH/CCD region 2 : centrálně lokalizované AK MH/CCD region 3 : C-terminální nucleotide substitions ( missense / nonsense ) small deletions RYR1 amino acid sequence

18 Strategie v mutační analýze RYR1 genu (dr. I. Valášková, OLF FN Brno) N-terminalní region centrálně lokalizovaný region Je prováděna PCR amplifikace exonů 6, 11, 12, 17, 39, 40, 45,46 PCR fragmenty jsou přímo sekvenovány na ABI PRISM zaměřili jsme se na dva regiony s největším výskytem mutací

19 PCR produkty analyzovaných exonů RYR1 genu 5% PAG dráha 1 - 8: exony RYR 1 genu dráha 9: molecular weight marker pBR322/AluI Exons: M

20 Single nucleotide polymorphism (H2420H) u dětského MH patcienta CT transice ve třetí kodonové pozici ( CAC - CAT ) nemění AK histidin, který je kodován kodonem C>T

21 Kdy je nalezená mutace kauzální ? nutný nález alespoň 2 rodokmenů (nepříbuzných MH vnímavých rodin) s danou mutací, mutace musí být potvrzena u více než 1 člena dané rodiny nutný nález alespoň 2 rodokmenů (nepříbuzných MH vnímavých rodin) s danou mutací, mutace musí být potvrzena u více než 1 člena dané rodiny negativní nález u 100 MHN jedinců pokrevně nepříbuzných (vyloučení polymorfizmu) negativní nález u 100 MHN jedinců pokrevně nepříbuzných (vyloučení polymorfizmu)

22 Nová strategie mutační analýzy RYR1 genu Použit screening RYR1 cDNA pro maximalizaci efektivity identifikace RYR1 mutací. Metoda: total RNA izolovaná z periferní krve cDNA syntéza PCR amplifikace částečně se překrývajících RYR1 cDNA segmentů, representují hot spot regiony RYR1 genu sekvenace bp dlouhých PCR productů

23 Strategie mutační analýzy RYR1 genu RNA cDNA RT PCR sekvenování cDNA fragmenty délky bp RYR1 cDNA sekvence/ distriduce RYR1 mutací nucleotide substitions ( missense / nonsense ) small deletions

24 Electroforeza PCR produktů RYR1 cDNA segmentů 1-9 5% PAG, silver stained weight marker 100 bp DNA Ladder M 600bp 700bp Chromatogram cDNA segment 9 (670 bp)

25 Národní centrum pro diagnostiku MH (NCDMH) v Brně ARO FN Brno ARO FN Brno ARK USA ARK USA OLG FN Brno OLG FN Brno vyhledávaání a databáze rizikových rodin (99 k ) vyhledávaání a databáze rizikových rodin (99 k ) diagnostika MH diagnostika MH

26 Tromboembolická nemoc a genetické rizikové faktory

27 Tromboembolická nemoc (trombofilie) vrozená či získaná porucha hemostatického mechanismu – příčina vzniku trombóz (venózní či arteriální) vrozená či získaná porucha hemostatického mechanismu – příčina vzniku trombóz (venózní či arteriální) patří mezi nejčastější příčiny úmrtí patří mezi nejčastější příčiny úmrtí incidence 1 – 5 případů /1000 osob ročně incidence 1 – 5 případů /1000 osob ročně

28 Klinické symptomy  vznik žilní trombozy do 45 let, arteriární do 35 let  opakované či atypické trombózy  hypertenze v těhotenství  infarkt placenty - potraty

29 Žilní tromboembolismus Vnější faktory Vnější faktory – kouření – úrazy – chirurgický zákrok – hormonální antikoncepce – obezita – imobilizace Vrozená predispozice Vrozená predispozice – Leidenská mutace (mutace v genu koagulačního faktoru V) – mutace v genu pro protrombin (faktor II)

30 Koagulace krve koagulace –fyziologický mechanismus chránící organizmus před ztrátou krve koagulace –fyziologický mechanismus chránící organizmus před ztrátou krve komplexní mechanismus kontrolovaný různými skupinami plazmaproteinů komplexní mechanismus kontrolovaný různými skupinami plazmaproteinů proces vyžadující jemnou rovnováhu mezi koagulačními a antikoagulačními faktory proces vyžadující jemnou rovnováhu mezi koagulačními a antikoagulačními faktory zpětnovazebný systém zpětnovazebný systém

31 Gen pro faktor V Genetická mapa: 1q23 Genetická mapa: 1q23 Leidenská mutace: Exon 10 Leidenská mutace: Exon 10 Bodová mutace G1691A, AD typ dědičnosti Bodová mutace G1691A, AD typ dědičnosti Substituce Arg506(CGA) to Gln(CAA) Substituce Arg506(CGA) to Gln(CAA) Faktor V (proakcelerin) – plazmatický protein 2196 AMK – prekurzor kofaktoru Va – syntéza trombinu – koagulace Faktor V (proakcelerin) – plazmatický protein 2196 AMK – prekurzor kofaktoru Va – syntéza trombinu – koagulace mutovaný faktor Va není správně inaktivován proteinem C (tzv. APC rezistence) !!! mutovaný faktor Va není správně inaktivován proteinem C (tzv. APC rezistence) !!!

32 Funkce faktoru V v procesu krevního srážení Proces krevního srážení A) fyziologický procesB) patologický proces faktor V faktor V faktor V faktor V trombin trombin trombin trombin propeptid propeptid propeptid propeptid faktor Va faktor Va s mutací (G1691A) faktor Va faktor Va s mutací (G1691A) APC APC APC APC inaktivní faktor V aktivní faktor V inaktivní faktor V aktivní faktor V tromby tromby tromby tromby

33 Přehled výskytu Leidenské mutace v některých populacích Řecko13% Řecko13% Švédsko11% Švédsko11% Francie10% Francie10% V. Británie 9% V. Británie 9% Německo 9% Německo 9% Holandsko 5% Holandsko 5% Polsko 5% ČR – 5,7 % !!! Polsko 5% ČR – 5,7 % !!! Argentina 5,1% Argentina 5,1% Venezuela 2,4% Venezuela 2,4% Costa Rica 2% Costa Rica 2% Indie 1,3% Indie 1,3% Čína vzácně Čína vzácně Čenošská populace nedetekováno Čenošská populace nedetekováno Japonsko nedetekováno Japonsko nedetekováno

34 Riziko trombózy u nosičů 1691A mutace riziko vzniku trombózy u nosičů mutantní alely se zvyšuje oproti normálnímu genotypu 5 – 10x u heterozygotů a 50 – 100x u homozygotů riziko vzniku trombózy u nosičů mutantní alely se zvyšuje oproti normálnímu genotypu 5 – 10x u heterozygotů a 50 – 100x u homozygotů u nosičů mutací jsou trombotické epizody často vyvolány: těhotenstvím, užíváním horm. antikoncepce, traumatem, chir. zákrokem, kouřením u nosičů mutací jsou trombotické epizody často vyvolány: těhotenstvím, užíváním horm. antikoncepce, traumatem, chir. zákrokem, kouřením riziko trombózy při užívání horm. antikoncepce je u heterozygotů 28 – 35 x vyšší !!! riziko trombózy při užívání horm. antikoncepce je u heterozygotů 28 – 35 x vyšší !!!

35 Mutace v genu pro protrombin substituce G na A (G20210A) substituce G na A (G20210A) frekvence v ČR 2,3 % frekvence v ČR 2,3 % u nosičů mutantní alely stoupá riziko trombózy 2 – 6 x u nosičů mutantní alely stoupá riziko trombózy 2 – 6 x Pokud je žena nosičkou mutantní alely faktoru V, zároveň nese mutaci pro protrombin a užívá hormonální antikoncepci – Pokud je žena nosičkou mutantní alely faktoru V, zároveň nese mutaci pro protrombin a užívá hormonální antikoncepci – riziko trombózy je 149x vyšší !!! Interakce dvou mutantních alel a jednoho vnějšího faktoru !!! Interakce dvou mutantních alel a jednoho vnějšího faktoru !!!

36 Metody pro detekci LM o RFLP - restrikční enzym MnlI o SSCP o detekční kit „Factor V Gene Mutation Assay“ o Real Time PCR (LightCycler)

37 Stanovení přenašečů Leidenské mutace v Brně Oddělení klinické hematologie FN Brno - Bohunice

38 Nositelé vadného genu CF – odolnost vůči onemocnění tyfem !!

39 Otázky Proč jsou pacienti s  -talasemií většinou složení heterozygoti ? V jaké situaci byste očekávali, že pacient s  - thalasemií má dvě identické alely genu pro  -globin ? Proč jsou pacienti s  -talasemií většinou složení heterozygoti ? V jaké situaci byste očekávali, že pacient s  - thalasemií má dvě identické alely genu pro  -globin ? Dítě zemřelo na fetální hydrops. Nakreslete rodokmen s genotypy, který rodičům, kteří jsou nosiči, ukáže dědičnou podstatu talasemie, jíž jejich dítě trpělo. Dítě zemřelo na fetální hydrops. Nakreslete rodokmen s genotypy, který rodičům, kteří jsou nosiči, ukáže dědičnou podstatu talasemie, jíž jejich dítě trpělo. Dítě má strýce z otcovy strany a tetu z matčiny strany se srpkovitou anémií. Oba jeho rodiče jsou zdrávi. Jaká je pravděpodobnost, že jejich dítě bude mát abnormální hemoglobin ? Dítě má strýce z otcovy strany a tetu z matčiny strany se srpkovitou anémií. Oba jeho rodiče jsou zdrávi. Jaká je pravděpodobnost, že jejich dítě bude mát abnormální hemoglobin ?

40 Příklady Onemocnění galaktosemie se dědí jako autozomálně recesivní znak. Zdravá dvojice má postižené dítě. Jaká je pravděpodobnost, že nastanou následující situace: A) následující dvě děti budou mít galaktosemii B) otec dítěte s galaktosemií je heterozygotem ve sledovaném znaku C) dítě, které má zdravá sestra nemocného je heterozygotem ve sledovaném znaku D) jakýkoliv potomek bude nemocný E) nevyskytne se žádný nemocný potomek u 3 následujících dětí F) jakékoli dítě bude dívka s galaktosemií, zdravý chlapec ?


Stáhnout ppt "Mutace vedoucí k farmakogenetickým chorobám Příklad: maligní hypertermie."

Podobné prezentace


Reklamy Google