Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Metody testování buněčné imunity. Buněčná imunita Bílé krvinky – leukocyty Nespecifická imunita: »Neutrofily »Eozinofily »Bazofily »Makrofágy »NK buňky.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Metody testování buněčné imunity. Buněčná imunita Bílé krvinky – leukocyty Nespecifická imunita: »Neutrofily »Eozinofily »Bazofily »Makrofágy »NK buňky."— Transkript prezentace:

1 Metody testování buněčné imunity

2 Buněčná imunita Bílé krvinky – leukocyty Nespecifická imunita: »Neutrofily »Eozinofily »Bazofily »Makrofágy »NK buňky Specifická imunita »T lymfocyty »B lymfocyty

3 Jak pracovat se vzorkem krve? Nesrážlivá krev – antikoagulans Dodat do 2h Zpomalení „stárnutí“ a aktivity při 4°C Funkční testy – neporušené buňky Vitalita → šetrná rychlá práce →

4 Co jsme schopni sledovat? (1/2) Vlastnosti Biologické »Velikost »Granularita »Viabilita Chemické »pH Fyzikální »Membránový potenciál Zastoupení (počty) jednotlivých populací Fenotypizace

5 Co jsme schopni sledovat? (2/2) Aktivita jednotlivých buněk Přímo – Průkaz samotné funkce Nepřímo – Exprese specifických molekul př.: »Aktivační markery – Exprese specifických produktů př.: »Cytokiny »Reaktivní kyslíkové intermediáty - oxidační vzplanutí »Enzymy »DNA

6 Průtoková cytometrie Současné měření vlastností buňky (částice) při průchodu laserovým paprskem Fyzikálních Chemických Biologických Měření každé buňky (částice) nejde o průměrné hodnoty měřené suspenze ↓ Kvalitativní i kvantitativní Analýza až b.(částic) / s

7 Lom světla (FCS x SSC) Buňky obaleny pláštěm nosné tekutiny Pod tlakem hnány do speciálního prostoru Lom světla po průchodu proudem suspenze – sledování směru úhlu lomu Přímý rozptyl (FSC) »Lom o 2°-13° – úměra velikosti buňky Boční rozptyl (SSC) »Rozptyl o 90° – indikátor buněčné struktury – – granularita

8 Analýza značených buněk (1/3) Pomocí fluidního systému Buňky obaleny pláštěm nosné tekutiny Pod tlakem hnány do speciálního prostoru Setkání laserového paprsku s procházející buňkou

9 Analýza značených buněk (2/3) Optický systém Excitační část »Laser »Soustava čoček a hranolů – usměrnění světelného paprsku Sběrná část »Optická zrcadla + filtry – detekce světelných kvant specifické vlnové délky

10 Analýza značených buněk (3/3) Elektronický systém Převod optického signálu na elektronický Digitalizace pro počítačovou analýzu → datový soubor

11 Grafické zobrazení měřených veličin (1/2) Jednoparametrový histogram Osa x – intenzita signálu Osa y – počet měřených buněk

12 Grafické zobrazení měřených veličin (2/2) Dvouparametrový histogram Osa x – intenzita 1. signálu Osa y – intenzita 2. signálu Počet měřených buněk »Dot plot – hustota bodů »Contour plot – hustota odpovídá čarám připomínajícím vrstevnice

13 Testy buněčné imunity

14 Detekce buněk, struktur, molekul pomocí protilátek → →

15 Fenotypizace buněk Charakterizace buněk pomocí specifických membránových či cytoplazmatických markerů Využití reakce antigen-protilátka Vizualizace → fluorochrom

16 Fenotypizace leukocytů pomocí CD znaků CD znaky = systematické označení většiny povrchových molekul leukocytů Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset Megan A. CooperMegan A. Cooper, Todd A. Fehniger, Sarah C. Turner, Kenneth S. Chen, BobakTodd A. FehnigerSarah C. TurnerKenneth S. ChenBobak A.GhaheriA.Ghaheri, Tariq Ghayur, William E. Carson, and Michael A. CaligiuriTariq GhayurWilliam E. CarsonMichael A. Caligiuri ZnakBuněčná populace CD45leukocyty CD3lymfocyty CD3/CD4Th (pomocné) lymfocyty CD3/CD8Tc (cytotoxické) lymfocyty CD19B lymfocyty CD16/CD56Natural Killers CD203Bazofily

17 Analýza značených buněk (2/3) Optický systém Excitační část »Laser »Soustava čoček a hranolů – usměrnění světelného paprsku Sběrná část »Optická zrcadla + filtry – detekce světelných kvant specifické vlnové délky

18 Grafické znázornění Obr.1 Fenotypizace Th lymfocytů Obr.2 Fenotypizace Tc lymfocytů Obr.3 Fenotypizace B lymfocytů Obr. 4 Fenotypizace NK buněk

19 Funkční testy leukocytů – Aktivace bazofilů (1/2) Stanovení míry alergické reakce Identifikace bazofilů znakem – CD203c Identifikace aktivovaných bazofilů – CD63 U klidových stádií bazofilů – CD63 součástí membrány granul obsahujících histamin Aktivace bazofilů → splynutí granul s cytoplazmatickou membránou = vystavení molekuly CD63 na buněčný povrch

20 Postup testu aktivace bazofilů Inkubace vzorku krve s IL-3 Podpora stimulace bazofilů – př. zvýšené uvolnění histaminu Možnost zvýšení exprese CD63 → zvýšení senzitivity testu Inkubace vzorku krve s alergenem Aktivace bazofilů Značení molekul: CD203c CD63

21 Funkční testy leukocytů (2/2) – Cytotoxický test Cytotoxicita = schopnost T lymfocytů a NK buněk zabíjet nádorové a infikované buňky př.: Cílové buňky – 51 Cr Zabití = uvolnění 51 Cr Měření radioaktivity supernatantu

22 Význam testování lymfocytárních populací Monitorování buněčné imunity Sekundární imunodeficity Traumata Sepse Pooperační stavy Diagnostika a prognostika zhoubných nádorů Diagnostika SCID a hypogamaglobulinémie Monitorování rozvoje štěpu po transplantaci kostní dřeně Testování nových léků (farmakologie, protinádorová imunoterapie)

23 Fagocytóza Fáze fagocytózy Diapedéza Chemotaxe Ingesce Usmrcení a destrukce fagocytovaných částic Proces pohlcování pevných částic buňkou

24 Testy fagocytárních funkcí Exprese adhezívních molekul Adherence k povrchu Reakce antigen-protilátka »Př. FACS Chemotaxe Ingesce Inkubace plné krve s polymerovými partikulemi nebo bakteriemi Fagocytóza partikulí nebo bakterií Vyhodnocení ve světelném mikroskopu chemotaxin (fMLP) suspenze testovaných buněk médium Chemotaxe

25 Testy fagocytárních funkcí Oxidační vzplanutí = schopnost tvořit reaktivní kyslíkové radikály Kyslíkové radikály – reakce se substrátem → detekce barevného substrátu FACS: dihydrorhodamin → rhodamin Mikroskopicky, spektrofotometricky bezbarvá diazoniová sůl (př.NBT) → formazan

26 Baktericidní test Testuje všechny fáze fagocytózy Inkubace plné krve (obsahuje opsoniny) s bakteriemi (C. albicans, S.aureus, E.coli ) Hodnocení schopnosti usmrtit mikroorganismy Očkování mikroorganismů na půdu – počítání kolonií Mikroskopicky – vitální barvení (trypanová modř = = mrtvé mikroorganismy)

27 Význam testování fagocytózy FUNKCETESTPORUCHA ADHEZEExprese CD11/ CD18LAD1 syndrom CHEMOTAXEMigrace pod agarózouPoruchy jsou poměrně vzácné; transientní jsou u infekcí, popálenin, traumatu INGESCEOpsonizace a pohlcení částic (metakrylátové partikule, mikroorganismy) Projeví se u poruch opsonizace RESPIRAČNÍ VZPLANUTÍ NBTDefektní u chronické granulomatózní choroby (CGD); transientní porucha u infekcí, traumatu, malnutrice Fluorescence Chemiluminiscence CELÝ PROCES FAGOCYTÓZY VČETNĚ USMRCENÍ MIKROORGANIZMU Baktericidní testUpozorní na poruchu některého z kroků fagocytózy (Litzman a spol., 2007)

28 Děkuji za pozornost


Stáhnout ppt "Metody testování buněčné imunity. Buněčná imunita Bílé krvinky – leukocyty Nespecifická imunita: »Neutrofily »Eozinofily »Bazofily »Makrofágy »NK buňky."

Podobné prezentace


Reklamy Google