Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková."— Transkript prezentace:

1 Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková

2 Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití Vlastní a nevlastní fluorescence Fluorescenční značky Fluorescenční sondy Příklady použití fluorescenčních sond

3 Fluorescence Fluorescence - schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky Stokesův posun Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)

4 Fluorescenční metody, možnosti použití Biochemický a biofyzikální výzkum –Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule Klinická chemie Genetické analýzy, genetické manipulace –Analýza DNA Biomedicína Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče Využití fluorescence Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách

5 Výhody fotoafinitních sond Afinitní sondy – nevýhody: možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo možnost interakce na jiném než vazebném místě Fotoaktivovatelná sonda: Chemicky inertní sonda chemicky reaktivní ozáření

6 Používané přístroje Přístroje: Fluorimetry Spektrofluorimetry Fluorescenční skenery Fluorescenční mikroskopy Průtokové cytometry Princip přístrojů využívajících fluorescenci

7 Měření fluorescence vzorek emisní monochromátor detektor zdroj excitační monochromátor čtecí zařízení Fluorimetr Jenway řady 6200

8 Fluorescenční mikroskopy FL 2002 K – Fluorescenční mikroskopFluorescenční mikroskop XFT 313

9 Software Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.

10 Endotelové buňky pod mikroskopem Fluorescenční mikroskop se třemi kanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro).

11 Vlastní a nevlastní fluorescence Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic) –vyskytují se přirozeně Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) –jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních

12 Nevlastní fluoroscence Fluorescenční značky látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně fluorescenční značení proteinů Fluorescenční sondy látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží nekovalentně Požadované vlastnosti specifická vazba na buněčné složky citlivost emise na změny v okolí podobnost s původní sloučeninou po zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů

13 Biologicky aktivní Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost skladování Stálé v podmínkách experimentu Krátký poločas – minimalizace nespecifického značení Vysoká specificita Snadná syntetická dostupnost Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie) Principy fotoafinitního značení

14 Fotoreaktivní skupina – modrá Radioizotop – červený Protein - zelený

15 Chemické struktury barev Alexa

16 Emisní spektra pro Alexa Fluor barevné serie

17 Alexa Fluor Cadaverine 647

18 Syntéza AFCS DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid

19

20 Specifičnost absorpce AFCS Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly

21 Rychlá absorpce AFCS Šipky ukazují endosomy označené AFCS

22 Pohyb AFCS v buňkách Signál AFCS se rychle ztrácí z PM a akumuluje se ve vakuolách

23 Pohyb AFCS v buňkách AFCS je v PM, endozomech (označeno šipkami) a hromadí se ve vakuolách

24 AFCS putuje z PM do vakuol

25 Význam AFCS Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách. Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.

26 Příprava steroidu pro navázání Alexy

27

28 Příprava aktivního esteru Alexy ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C

29 Alexa navázaná na steroid

30

31 DHEA (1), Photo-DHEA (2), a DHEA-Bodipy (3)

32 Další fluorofory 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

33 BODIPY b boron-dipyrromethene 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene Skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bór Použití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů

34 Struktury BODIPY

35 Dansylchlorid Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid

36 Fluorescentní steroly pro studium pohybu cholesterolu v živých buňkách

37 Závěr Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci. Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího. Přehled je možno nalézt na stránkách

38 Literatura Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231 Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku probes.com

39


Stáhnout ppt "Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy Jaroslava Hniličková."

Podobné prezentace


Reklamy Google