Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Analýza a separace nukleových kyselin. Literatura.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Analýza a separace nukleových kyselin. Literatura."— Transkript prezentace:

1 Analýza a separace nukleových kyselin

2 Literatura

3 PCR Mullis

4

5

6 Real time PCR

7 Real time PCR proteinů

8 Genetická daktyloskopie

9 Použití restrikčních enzymů - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

10 Short tandem repeats

11

12

13 Testy paternity Zjednodušené testy  STR na Y chromosomu – mužských potomků srovnání s otcem  Mitochondriální DNA – dědí se po matce – matroklinní dedičnost

14 Mitochondriální Eva

15 DNA chipy

16

17

18

19 DNA chipy - barva skvrn

20 DNA chipy - vybavení

21 DNA chipy software

22

23 Proteinové chipy

24 Proteinové chipy – typy interakcí Protilátka Antigen Ligand Detekce: SELDI MS, fluorescence, SPR, electrochemická, radioaktivity,

25 Lecture Anti-GST Probe

26 Blotting  Southern – DNA  Nothern – RNA  Western - bílkoviny

27 Izolace nukleových kyselin

28 Cíl izolace  Odstranění proteinů  DNA vs RNA  izolace specifického typu NK

29 Typy NK  genomická (chromosomalní)  organelová (mitochondrie, chloroplasty)  plasmidy (extra-chromosomalní)  virová (ds nebo ss)  komplementární (mRNA)

30 Nejpoužívanější metody  na základě rozdílné rozpustnosti – extrakce, srážení  na základě vlastností - chromatografie – polarita- adsorpční, náboj-ionexová  sedimentace - gradientová ultracentrifugace

31 Postup 1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK 2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). 3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. Extrakce/PrecipitaceExtrakce/Precipitace ChromatografieChromatografie UltracentrifugaceUltracentrifugace

32 Extrakce/Precipitace

33 Organic extractio n

34 Izolace genomické DNA Typická procedura 1.Sklizení buněk 2.Lyse buněk –0.5% SDS + proteinase K (55 o několik hodin) 3.Fenolová extrakce –Jemné třepání několik hodin 4.Ethanolová precipitace 5.Působení RNAsy a proteinasy K 6.Opakování kroku 3 a 4.

35 Hrubý lyzát obsahující NK a další součásti buňky Smíchání vzorku s organickou fází ve stejném poměru. e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Centrifugac e Vodná fáze obsahuje NK, organická fáze bílkoviny a lipidy. Nerozpustné složky přítomné v interfázi. Opakovaná extrakce pro zvýšení čistoty Použití vodné fáze Extrakce/Precipitace Krok 3: Organická extrakce Organická fáze Vodná fáze Interfáze

36 Přidání EtOH a soli Supernatant Pelet 70% EtOH Rozpuštění (H 2 O, TE, etc.) Krok 4: Precipitace NK Extrakce/Precipitace Před Po Centrifug ace PromytíCentrifugace 2-2,5 objem EtOH -20 o C Vysoká I pH 5-5.5

37

38 Chromatografie

39 Adsorpční chromatografie

40

41 Eluce zvýšením pH nebo vysokou I Ionexová chromatografie Vazba při nízkém pH nízké I

42 Gradientová centrifugace

43 Diferenciální versus gradientová centrifugace

44 Separation of Nucleic Acids by CeCl Gradient Centrifugation

45 Plasmid DNA

46 Izolace RNA - speciální přístupy nutno použít inhibitory RNAsy extrakce guanidium chloridem fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) působení RNase-free Dnase selektivní precipitace rRNA, mRNA s LiCl oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA

47 Kontrola čistoty a kvantifikace NK

48 genomická DNA (degradovaná) Kontrola degradace: DNA

49 Kontrola degradace: RNA 25S 18S


Stáhnout ppt "Analýza a separace nukleových kyselin. Literatura."

Podobné prezentace


Reklamy Google