Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Neurochemie: Neuropřenašeče: excitační a inhibiční aminokyseliny (glutamát, glycin, GABA) 3. přednáška.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Neurochemie: Neuropřenašeče: excitační a inhibiční aminokyseliny (glutamát, glycin, GABA) 3. přednáška."— Transkript prezentace:

1 Neurochemie: Neuropřenašeče: excitační a inhibiční aminokyseliny (glutamát, glycin, GABA) 3. přednáška

2 Aminokyseliny (AA) = základní stavební bloky proteinů  účastní se intermediátního metabolismu, v buňkách jsou vysoce koncentrovány  Je nějaká aminokyselina (AA) neuropřenašeč? Přinejmenším tyto 4 ano: jde o excitační aminokyseliny glutamát a aspartát a inhibiční neuropřenašeče kyselinu  - aminomáselnou (GABA) a glycin. I. Excitační AA... využívá téměř každý informační neuronální okruh, podílejí se na utváření normálních synaptických kontaktů a jsou zapojeny i do takových patofyziologických procesů, jakými jsou např. epilepsie, ischemie, poškození mozku, úzkostné stavy či závislosti.  hlavní excitační přenašeč CNS  účastní se rychlého excitačního synaptického přenosu  enzymy syntézy i degradace glutamátu jsou přítomny v neuronech i gliích, stejně jako vysokoafinitní transportéry aminokyselin  glutamát i aspartát = neesenciální AA neprocházející hematoencefalickou bariérou  syntetizovány z glukosy a dalších prekurzorů  po výlevu je glutamát primárně vychytáván gliemi, ve kterých je konvertován glutaminsynthetasou na glutamin  vzniklý glutamin je transportován Na + a H + -dependentní pumpou N-1 (SN1) homologní vesikulárnímu GABA transportéru (VGAT)  glutamin je vychytáván glutamátergním nervovým zakončením, konvertován glutaminasou zpět na glutamát a použit k dalšímu výlevu Glutamát

3 Výlev a zpětné vychytávání glutamátu  synaptické váčky aktivně akumulují glutamát spolu s ionty Mg 2+  koncentrace glutamátu ve váčku může dosáhnout až 20 mM  plnění: vesikulární glutamátový transportér (VGluT) s vysokou afinitou pro glutamát a signifikantně nižší pro aspartát  po výlevu rychle zpětně vychytáván, což zajišťují přinejmenším dvě rodiny glutamátových transportérů  transport glutamátu zpět do zakončení je elektrogenní  využívá elektrochemického gradientu Na +, H + a K + (přenos glutamátu a aspartátu i proti jejich gradientu koncentračnímu)  transportéry velmi rychle schopny snížit hladinu glutamátu v synaptické štěrbině na submikromolární koncentraci  vychytávají glutamát i aspartát se stejnou afinitou a zhruba stejnou rychlostí, mohou transportovat i D-aspartát, ale nikoliv D-glutamát  transport je elektrogenní: s každou molekulou glutamátu je přenesen jeden proton a tři ionty sodíku do buňky a zároveň jeden ion draslíku ven V materiálu z potkanů a mloků byly vyklonováni čtyři zástupci této vysoceafinitní rodiny glutamátových transportérů: GL AST (glutamate-aspartate transporter) GLT-1 (glutamate transporter-1) EAAC (excitatory amino acid carrier-1) a sEAAT5 (salamander excitatory amino acid transporter-5 )

4 EAAT1-2 – membrána astrocytů, oligodendriglií a mikroglií EAAT1- dominantní v mozečku (6x víc než EAAT1, 10x víc než EAAT4) EAAT2 – vychytá 90-95% Glu v předním mozku nízké hladiny EAAT2 také v axonových terminálách CA3 pyramidových buněk hipokampu EAAT3 – hipokampus, bazální ganglia, mozeček, hlavně dendrity = asi spíše homeostatická úloha než přímé ovlivnění neurotransmise EAAT4 - zejména mozeček EAAT 5 – sítnice (fotoreceptory, bipolární buňky) Lidskými homology jsou EAAT1, EAAT2, EAAT3 a EAAT5; EAAT4 byl naklonován v lidském motorickém kortexu. Vychytávání glutamátu v CNS se predominantně účastní GLAST a GLT-1. Stechiometrie elektrogenního transportu glutamátu Z Physiological Reviews October 2013 Vol. 93 no. 4,

5 Výlev a vychytávání glutamátu na synapsi Excitotoxicita (ischémie): akumulace glu/asp v synaptické štěrbině  masivní aktivace glutamátových receptorů  stimulační ligandy glutamátových transportérů? Bohužel, k dispozici jsou pouze inhibitory, např.: THA (D,L-threo-3-hydorxyaspartát, širokospektrý antagonista glutamátového a aspartátového transportu) či DHK (dihydrokainát, selektivní inhibitor gliálního GLT-1). !!! CEFTRIAXON !!! (7-[[(2Z)-2-(2-Amino-4-thiazolyl)-2-(methoxyimino)acetyl]amino]- 8-oxo-3-[[(1,2,5,6-tetrahydro-2-methyl-5,6-dioxo-1,2,4-triazin-3- yl)thio]methyl]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid disodium salt)

6 CEFTRIAXON Rothstein et al (2005) β-Lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression. Nature Lipski et al (2007) Neuroprotective potential of ceftriaxone in in vitro models of stroke. Neuroscience   -laktamové antibiotikum (cefalosporin III. generace)  prochází přes hemetoencefalickou bariéru  podle některých autorů ceftriaxon zvyšuje expresi GLT1 (EAAT2)  podle jiných spíše ovlivňuje transportní charakteristiky GLT1 (změna ve fosforylaci?, změna termodynamických nebo kinetických faktorů?)  má chelatační vlastnosti – může jejich snižovat toxický dopad některých kovů při oxidačním stresu jejich vyvázáním (GLT1 aktivnější, více exprimován na membráně)  výsledky nejednotné (vpravo zpoždění negativních potenciálů při šířící se hypoxické depresi)

7 Glutamátové receptory Dvě veliké rodiny: receptory ionotropní (formují iontový kanál) a receptory metabotropní (spřažené s G-proteiny). Ionotropní receptory zahrnují tyto třídy zástupců, pojmenované podle ligandů, které kromě glutamátu také váží: NMDA receptory (N-methyl-D-aspartát, analog glutamátu) AMPA (Q) receptory (  -amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionová kyselina) KA receptory (kainátové receptory, kyselina kainová)  tetramery složené z různých podjednotek  AMPA a NMDA receptory na synapsích kolokalizovány, ale jejich vzájemný poměr je velmi variabilní: existují i synapse „osázené“ výhradně jen AMPA či jen NMDA receptory  kódovány nejméně 16 geny  uvnitř každé receptorové rodiny (AMPA, NMDA, KA Rs) panuje až 80% homologie, mezi jednotlivými rodina pak homologie zhruba 50% Po vazbě glutamátu na AMPA a/nebo NMDA receptor lze pozorovat smíšený excitační postsynaptický proud. Je dvousložkový: první, rychlejší složka s vyšší amplitudou je nesena AMPA receptory druhá (pomalejší a s nižší amplitudou pak NMDA receptory

8 Doba poklesu proudové odpovědi navozené NMDA receptorem může být až 100krát delší než doba samotného otevření kanálu. Proč se odpovědi AMPA a NMDA Rs liší? NMDA Rs mají vyšší afinitou ke glutamátu (Kd = 3-8 nM), takže ten z NMDA receptoru disociuje podstatně pomaleji než v případě AMPA R (ten je nízkoafinitní s Kd = 200 nM). Pomalejší kinetika NMDA Rs mj. podmiňuje mechanismus časoprostorové sumace (mohou se přidat příspěvky dalších synapsí a navodit depolarizaci nutnou k zahájení akčního potenciálu.

9 Typická excitační synapse (bez KA Rs, které jsou buď pre- nebo postsynaptické podle typu synapse) NMDA glutamát kyselina kainová

10 AMPA a KA receptory: fyziologie a farmakologie  AMPA Rs vedou primárně dovnitř tekoucí sodíkový proud (který je vyvažován ven tekoucím proudem draslíkovým)  některé AMPA Rs neuronů a astrocytů striata, hippokampu či mozečku propouští také Ca 2+, což je extrémně důležité pro buňky, které nejsou vybaveny NMDA receptory  selektivní blok AMPA Rs např. silným kompetitivním antagonistou NBQX (6-nitro-7-sulfamobenzo-quinoxalin 2,3-dion); jeho účinek na jiné Rs je velmi slabý nebo 0  nekompetitivní antagonisté AMPA Rs: některé benzodiazepiny jako GYKI (slibné v neuroprotekci po mrtvicích; bez vlivu na jiné kategorie glutamátových receptorů AMPA Rs desensitizují po expozici svému ligandu během milisekund, KA receptory v podstatě obratem. Farmakologicky je leze odlišit pomoci jejich odpovědi cyklothiazid a lektin konkavalin A. Cyklothiazid zpomaluje desenzitizaci AMPA Rs bez ovlivnění KA Rs, konkavalin A interaguje s povrchovými cukernými zbytky KA Rs, ale neovlivňuje AMPA Rs.

11  AMPA Rs: tetramery složené z podjednotek GluR1 – GluR4 (GluRA-D)  každá z podjednotek kódována vlastním genem  existuje ve dvou formách, flip a flop vzniklých alternativním sestřihem, lišících se svou distribucí v mozku a dobou desensitizace receptoru  nejlépe charakterizovaná podjednotka AMPA Rs: GluR1 s předpokládaným počtem aminokyselin 889  extradélka GluR1 podjednotky je dána neobvykle dlouho N-koncovou extracelulární doménou Molekulární složení AMPA a KA receptorů

12  podjednotky AMPA Rs mají pouze tři transmembránové segmenty (nikoliv 4)  to, co vypadá jako zkrácený transmembránový segment mezi segmenty M2 a M3, je smyčka, která dvakrát vstupuje do cytoplasmy  pro vazbu ligandu je kruciální krátká oblast mezi M1 a M3 transmembránovými segmenty  AMPA receptory bez GluR2 podjednotky jsou vysoce propustné pro Ca 2+ díky záměně jediné aminokyseliny v smyčce mezi M2 a M3 segmenty  Q/R místo: podjednotka GluR2 obsahuje arginin (R), zatímco podjednotky GluR1, 3 a 4 obsahují glutamin (Q)  záměně dochází během speciální editace RNA: gen pro GluR2 podjednotku kóduje glutamin, ale většina mRNA je editována tak, aby obsahovala kodon pro arginin  Q/R místo GluR2 podjednotek snižuje vodivost AMPA receptoru a jeho senzitivitu vůči blokádě pavoučími nebo endogenními polyaminy Ačkoliv AMPA receptory fungují primárně jako iontové kanály, zdá se, že mohou vyvolávat fyziologickou odpověď i jinými mechanismy. Aktivace AMPA Rs může vést i k aktivaci tyrosinkinasy Lyn. Tato aktivace je nezávislá na vtoku sodných i vápenatých iontů. Fyziologický význam tohoto jevu zatím nebyl objasněn.

13 NMDA receptory: fyziologie a farmakologie  při hodnotě membránového potenciálu nižší než cca –50 mV ionty hořčíku (Mg 2+ ) dokáží i v přítomnosti glutamátu nebo aspartátu v podstatě potlačit tok iontů NMDA receptorem  Mg 2+ se rychle pohybuje z/do otevřeného kanálu a způsobuje rychlé krátké inhibice toků proudů (flickery channel block)  nutnost depolarizace (ideálně aspoň o 30 mV) bývají NMDA Rs někdy označovány také jako hybridní kanály (nestačí jim jen ligand)  NMDA Rs vedou k Na + a K +, R vysoce propustný pro Ca 2+  permeabilita NMDA Rs pro Ca 2+ je asi 10  vyšší než pro Na +  NMDA Rs procházejí i další bivaletní kationy: Ca 2+ > Ba 2+ > Sr 2+ >> Mn 2+  aktivace NMDA Rs za klidového membránového potenciálu může vést k takové depolarizaci, aby navodila vznik akčního potenciálu, zdá se, že primární funkce NMDA Rs spočívá spíše ve zvyšování intracelulárních koncentrací Ca 2+ díky synaptické aktivitě  ke své aktivaci potřebuje dva agonisty: glutamát a glycin  ani jeden z nich sám neotevře kanál NMDA receptoru: koagonisté NMDA Rs  vazebné místo pro glycin: cykloserin (původně antituberkulotikum) je slabý parciální agonista; může zesilovat účinek antipsychotických farmak u schizofreniků  specifičtější agonisté jako HA966 nejsou v klinické praxi užíváni  vazebné místo pro glutamát je rozpoznáváno i strukturně podobnými agonisty, jejichž uhlíkatý řetězec je často prodloužen a navíc  -karboxyskupina je typicky nahrazena zbytkem kyseliny fosfonové (za vzniku antagonisty)  takto vzniká skupina kompetitivních agonistů, kteří jsou ovšem polární a téměř neprocházejí hematoencefalickou bariérou (AP-5, 2R-CPPen)

14  vazebné místo pro Mg 2+ nebo jeho těsné sousedství: sem se váží látky jako fenylcyklidin (PCP, „andělský prach – angel dust“) a farmaka jako ketamin  působí jako nekompetitivní antagonisté, kteří okludují kanál receptoru  mají značný vliv na funkci mozku  v nízkých koncentracích působí psychotomimeticky a navozují kognitivní poruchy (halucinace, iluze) podobné některých symptomům schizofrenie  ve vyšších dávkách působí jako disociativní anestetika  ketamin je oblíben pediatry – děti nejsou tolik náchylné k vedlejším efektům psychotického typu  vysoké dávky ethanolu hraničící s horní hranicí otravy vyvolávají u lidí na NMDA receptorech podobné změny jako fenylcyklidin a jemu příbuzné látky  pH: protony limitují frekvenci, s jakou se kanál otevírá, a při pH 6.0 je jeho funkce téměř zcela potlačena  v jeho aktivaci hrají klíčovou roli ionizovatelné aminokys. zbytky jako histidin nebo cystein NMDA receptory: fyziologie a farmakologie

15 Vazebná místa NMDA receptoru 5,7-dichlorokynurenová kyselina PCP ketamin

16 Molekulární složení NMDA receptorů  dvě hlavní rodiny NMDA receptorových podjednotek (NR1 a NR2) a jedna malá rodina modulačních podjednotek označovaných jako NR3 podjednotky  NMDA Rs v dospělém savčím mozku je tvořena 4 podjednotkami (NR1-NR2 heterotetramery)  homotertamerní NMDA receptory složené z NR1 nesou proud asi 100krát menší než NMDA Rs heterotetramerní  NR3 podjednotky jsou exprimovány zejména ve vyvíjejícím se CNS a v dospělém savčím mozku nehrají zdá se žádnou roli NR1 podjednotek bylo vyklonováno již více než 9. S NR1 podjednotkami se kombinuji podjednotky NR2, které moduluji farmakologický profil či citlivost kanálu k Mg 2+. Zajímavá je časná postnatální výměna NR2B podjednotek v heterotetrameru za podjednotky NR2A. Zatímco původní kanál vyvolával dlouhodobé synaptické odpovědi a byl velmi náchylný k inhibici ifenprodilem, po výměně NR2B podjednotky za NR2A v prvních týdnech života vymizí citlivost NMDA receptoru k ifenprodilu a zkrátí se doba jeho synaptické odpovědi. V páteřní míše jsou rovněž ve vysokých koncentracích exprimovány podjednotky NR2C a NR2D.

17 NMDA receptory: synaptická plasticita  vysoká permeabilita NMDA Rs pro vápník = značný dopad na řadu buněčných funkcí  běžná cytoplasmatická koncentrace Ca 2+ cca 100 nM  po aktivaci NMDA Rs může lokálně stoupnout až na řádově mikromoly  aktivace řady Ca 2+ -dependentních enzymů (Ca 2+ /kalmodulin dependentní proteinkinasy, kalcineurin, proteinkinasu C, fosfolipasu A 2, NO synthasu a jiné)  roku 1973 Bless a Lomo ukázali, že pokud je vysokofrekvenčně stimulován aferentní axon, který inervuje právě depolarizovanou postsynaptickou buňku, vyvolá odpověď daleko větší, než by odpovídalo odpovědi po stimulaci membrány nedepolarizované  jev byl patrný ještě řadu hodin po prvním vysokofrekvenčním dráždění a opakované episody stimulace jej mohly vyvolat i několik týdnů  dnes označováno jako LTP a považován za jeden z mechanismů tvorby paměťové stopy

18 LTP na molekulární úrovni  potřeba stimulačního vstupu působícího na již depolarizovanou postsynaptickou membránu  vzpomeňte si, že AMPA Rs potřebují ke své aktivaci jen výlev glutamátu (presynaptickou aktivitu), a jsou schopny navodit depolarizaci postsynaptické membrány  NMDA Rs potřebují ke své aktivaci navíc ještě depolarizaci v řádu cca tří desítek mV (aktivitu postsynaptickou)  po otevření NMDA Rs a vtoku vápníku do postsynaptického elementu dochází k další depolarizaci  mechanismus vzniku LDT (dlouhodobého aktivitně závislého poklesu synaptické účinnosti) je téměř identický  jen je zapotřebí nižších koncentrací vápníku Souvisí to pravděpodobně s kompeticí kinas a fosfatas. Při vyšší koncentraci vápníku je přednostně stimulována CaM kinasa II – enzym s nižší afinitou k vápníku, a dochází k fosforylaci AMPA receptorů. Naopak při LTD se vápník při svých nižších koncentracích přednostně váže na kalcineurin – enzym s vyšší afinitou k vápníku, který pak stimuluje proteinfosftasu 1. Ta AMPA receptory defosforyluje.

19 LTP a LTD na molekulární úrovni

20 Stimulace CaM kinasy II  fosforylace AMPA receptorů  změna vazby naTARPs (transmembrane AMPA receptor regulatory proteins, Ser831) LTP = zvyšování počtu AMPA receptorů na synapsi LTD = snižování počtu AMPA receptorů na synapsi Fosforylace na Ser845 reguluje pravděpodobnost otevření AMPA Rs jeho exocytosu jeho zakotvení v perisynaptické oblasti spolu s fosforylací na Ser831 je pro LTP klíčová LTD – defosforylace na Ser845 a Thr840 Z Dialogues Clin Neurosci Mar;15(1):11-27.

21 LTP a LTD  původní studie na králičím hippokampu  LTP také v kortexu, mozečku, amygdale aj.  některé typ hippokampální LTP závislé na NMDA receptorech (Schafferovy kolaterály), jiné na mGluRs (mechová vlákna)  Hebbovská, ne-Hebbovská, anti-Hebbovská LTP  Bienenstock, Cooper a Munro model: existují prahy postsynaptických odpovědí, postsynaptická odpověď pod určitý práh vede k LTD, nad něj k LTP

22 Delta ionotropná glutamátové receptory: čtvrtý typ glu IKs?  delta2 podjednotka nutná pro LTP Purkyňových buňkách mozečku  deficitní myší také vykazují potíže s motorickou koordinací a motorickým učením  vazebné místo pro D-serin  vápník jako první posel – delta Rs mohou sloužit jako Rs pro detekci deplece extracelulárního vápníku Schmid S. & Hollmann M: To Gate or not to Gate: Are the Delta Subunits in the Glutamate Receptor Family Functional Ion Channels? Mol Neurobiol (2008) 37:126–141

23 Metabotropní glutamátové receptory (mGluRs)  zatím naklonováno 8 různých podjednotek mGluRs označovaných jako mGluR 1-8 a dělených do tří tříd  tyto receptory jsou větší než jiné receptory spřažené s G-proteiny  potence glutamátu varírují mezi 2 nM pro mGluR 8 po 1  m promGluR 7  míra homologie s nimi není příliš vysoká  ale vyznačují se velice dlouhou N-koncovou doménou, která extracelulárně předchází transmembránovým segmentům.  v rámci jednotlivých tříd mGluRs existuje asi 70% sekvenční homologie  mezi třídami pak homologie asi 45% Rozdělení do tříd je založeno na základě mechanismu přenosu signálu: skupina I stimuluje fosfolipasu C cestou G q proteinů skupina II a III inhibují adenylylcyklasu cestou G i /G o proteinů a regulují specifické Ca 2+ a K + iontové kanály  vysoce selektivní agonisté pro každou z těchto tří skupin mGluRs  skupinu I mGluRs agonisticky ovlivňuje DHPG (3,5-dihydroxyfenylglycin)  pro skupinu II je vysoce selektivním a středně potentním agonistou APDC (2R,4R-4- aminopyrrolidin-2-4-dikarboxylát)  modelovým agonistou skupiny III je L-AP4 (L-amino-4-fosfonobutyrát). V současnosti probíhají klinické testy s agonisty II/III skupiny mGluRs odvozenými od látky Eglumegad (LY354740), který by mohly být farmakem terapie úzkostných stavů a možná i antipsychotikem.

24 Modulace aktivity iontových kanálů cestou metabotropních Glu Rs  modulují velmi různorodým způsobem funkci řady ligandem ovládaných i napěťově závislých iontových kanálů v neuronech CNS  L-AP4 působí na skupině III mGluRs v bipolárních neuronech sítnice a způsobuje hyperpolarizaci jejich membrány – glutamát obvykle centrální neurony depolarizuje (hyperpolarizace navozena cestou G-proteinů aktivujících fosfodiesterasu, která  hydrolyzuje cyklické nukleotidy normálně udržující Na + kanály otevřené)  aktivace mGluRs vede k inhibici L–typu napěťově ovládaných Ca 2+ kanálů, mGluRs třídy II a II regulují také N-typ Ca 2+ kanálů  v hippokampu nebo na cholinergních neuronech putamenu uzavírají napěťově ovládaných K + kanálů  pomalá depolarizace a excitace neuronů  na granulárních buňkách mozečku vede aktivace mGluRs k poklesu aktivity Ca 2+ - dependentních draslíkových kanálů (označovaných jako BK kanál) a snížení excitability buňky  presynapticky na glutamátergní synapsi tyto presynaptické mGluRs inhibují P/Q typ Ca 2+ kanálů a tím inhibují výlev neuropřenašeče (inhibiční autoreceptory).

25 Modulace aktivity iontových kanálů cestou metabotropních Glu Rs

26 těžký otok pravé mozkové hemisféry, posun středových struktur Autoimunitním atak receptorových podjednotek GluR 3 : Rasmussenova encefalitida Jde o chorobu propukající v raném dětství a spojenou s epilepsií a progresivní degeneraci jedné z mozkových hemisfér. léze s lokálním otokem mozku (parietální a okcipitální lalok)

27 GABA (kyselina  -aminomáselná)  GABA = hlavním inhibičním neuropřenašeč savčího CNS  GABAergní neurony zahrnují velmi různorodě skupiny neuronů (interneurony inhibiční až neurony projekční)  GABA jako neuropřenašeč ryze inhibiční, který hyperpolarizuje membrány postsynaptických buněk? NE: role GABA je komplexnější  např. během vývoje CNS může GABA působit i jako transmiter excitační, navozující depolarizaci membrány  GABA uvolňovaná z inhibičních interneuronů malých lokálních obvodů se spoluúčastní generování membránových oscilací (např. theta rytmy EEG)  GABAergní funkce alterovány v případě řady neuropsychiatrických onemocnění jako epilepsie, Huntingtonova choroba, dyskineze, alkoholismus či poruchy spánkového rytmu Syntéza a odbourávání GABA GABA určená pro synaptický přenos vzniká v metabolických drahách souhrnně označovaných jako tzv. GABA shunt. Podobně jako při syntéze glutamátu je obecným prekursorem GABA glukosa, jako prekursor může sloužit i pyruvát. GABA je plněna do váčků v terminále pomocí vesikulárního transportéru pro GABA. jeho primární sekvence naznačuje, že je složen z 9 transmembránových segmentů a velmi dlouhé cytoplasmatické N-koncové smyčky o délce asi 130 aminokyselin. Podobně jako VGluT je i tento transportér závislý na elektrickém gradientu na membráně váčku. Jeho specifické inhibitory zatím nejsou známy.

28 1.Prvním krok syntézy GABA: konverze  -ketoglutarátu na glutamát působením enzymu  -oxoglutaráttransmaminasa (GABA transaminasa nebo též GABA-T) 2.Následuje dekarboxylace kyseliny glutamové (dekarboxylasou kyseliny glutamové, GAD) na GABA. Po výlevu je GABA vychytávána zpět do neuronů nebo glií. V gliích je metabolizována na sukcinylsemialdehyd pomocí GABA-T. Tento transaminační krok probíhá v gliích tehdy, když je přítomen i  -ketoglutarát, aby mohl sloužit jako akceptor aminoskupiny odštěpené z GABA. Jsou známy specifické inhibitory pro GABA-T, které jsou vyvíjeny jako antikonvulsanty. Velmi slibné klinické výsledky má zatím např. vigabatrin. Ten je posléze konvertována na kyselinu glutamovou a ta transportována zpět do neuronů (glie neobsahují GAD), kde je přeměněna na GABA.

29  neobvyklý počet TM domén  exprese VGAT se mění postnatálně  během vývoje mozku počet VGAT klesá  v hippokampu se dokonce mění lokalizace VGAT pozitivních synapsí  kolem P7 se postsynaptická odpověď na GABA mění z excitační na inhibiční  redistribuuje GABA terminál spolu se změnami v expresi chloridových transportérů je podkladem této konverze  spekuluje se o účincích SSRI na vliv VGAT  jako jediný ve stejné míře závislý na gradientu pH i potenciálu

30 Farmakologie výlevu a zpětného vychytávání GABA Výlev standardní cestou (blokuje jej např. antikonvulsant gabapentin; mechanismus jeho působení ale zatím není popsán)  reuptake za přítomnosti extracelulárního Na + a Cl: dva ionty sodíku a jeden ion chloridový jsou přeneseny s každou molekulou GABA Pomocí klonování byly odlišeny čtyři (původně byla očekávána nižší heterogenita) různé GABA transportéry: GAT-1, GAT-2, GAT-3 a BGT-1. Inhibitory zpětného transportu GABA : farmakologicky důležité, profily transportérů se liší Inhibicí vychytávání GABA všechny tyto látky zvyšují její dostupnost v synaptické štěrbině a tím potencují její inhibiční efekt v rámci CNS. hydroxynipekotová kyselina: na membráně glií, její selektivita pro gliální transportéry je asi 20  vyšší než pro transportéry na membráně nervové terminály příbuzné inhibitory kyselina nipekotová a guvacin blokují obojí transportéry přibližně se stejnou afinitou jako hydroxynipekotová kyselina (IC 50 = mM) L-DABA (2,4-diaminomáselná kyselina) a ACHC jsou přibližně 4  méně účinnější  - alanin, hypotaurin a taurin vykazují ještě nižší potenci vůči GAT-1 NNC-711: jeden z nejpotentnějších inhibitorů GAT-1 transportéru, lipofilní derivát guvacinu (j eho IC 50 je menší než 400 nM; inhibuje i transport přes GAT-3 transportér, ale se zhruba  nižší selektivitou) antikonvulsanta tiagabin a lipofilní inhibitory Cl-966 a SKF GAT-1 transportér

31 GAT-2, GAT-3 a BGT-1 transportér Farmakologické profily transportérů GAT-2 a GAT-3 se od profilu GAT-1 liší.  GAT-2 a GAT-3 vykazují výrazně nižší afinitu ke guvacinu a kyselinám nipekotové i hydroxynipekotové, stejně jako k  -alaninu, hypotaurinu a taurinu  transportér BGT-1 (primárně lokalizován v ledvinách) má také odlišnou farmakologii: je inhibován např. phloretinem a quinidinem  velmi slabými antagonisty BGT-1 jsou i  -alanin, L -DABA a nipekotová kyselina Tricyklická a tetracyklická antidepresiva:  desiparamin a maprotilin inhibují všechny subtypy GABA transportérů se zhruba stejnou potencí  jejich afinita ke GABA transportérům je ale výrazně nižší než např. ke transportérům pro serotonin  naopak amytriptylin blokuje zpětný transport GABA přes GAT-1 a GAT-3 s afinitou jen asi 10  nižší než je jeho afinita pro serotoninový transportér  zda tyto látky svým působením na transportéry GABA potencují své působení jako antidepresiv, není zatím známo desipramin maprotilin

32 GABA receptory Podobně jako glutamátové receptory lze i GABA receptory rozdělit do dvou velkých funkčních skupin: ionotropní GABA A (a GABA A -  = GABA A rhó receptory nazývané též ev. GABA C ) receptory formující chloridový kanál a metabotropní GABA B receptory, spřažené s G-proteiny. GABA A a GABA C receptory  pentamerické iontové kanály propustné pro chloridy  první klonování podjednotek GABA A R v roce 1987, zatím 16 lidských podjednotek: 6 α podjednotek (GABRA1, GABRA2, GABRA3, GABRA4, GABRA5, GABRA6) 3 β podjednotky (GABRB1, GABRB2, GABRB3) 3 γ podjednotky (GABRG1, GABRG2, GABRG3) δ podjednotka (GABRD) ε podjednotka (GABRE) π podjednotka (GABRP) a θ podjednotka (GABRQ)

33  podjednotky o velikosti asi 50 kDa  podobná membránovou topologii: dlouhou extracelulární N-koncovou doménu, 4  -helikální transmembránové segmenty (M1-M4) a krátkou extracelulární C-koncovou doménu  podjednotky mezi sebou vykazují 70-80% homologii (krysy)  evolučně patří do superrodiny receptorů s receptory acetylcholinovými, glycinovými a 5HT 3 receptory  vykazují s nimi asi 25% homologii  diversifikovaly via duplikace a mutace ze společného genového předka  vysoká heterogenita GABA A receptorových podjednotek: alternativní sestřih  např. dvě různé verze  2 nebo  2 podjednotek: isoformy se liší přítomností krátké peptidové sekvence mezi transmembránovými segmenty M3 a M4, která obsahuje fosforylační místo pro proteinkinasu C  alternativní sestřih popsán i u podjednotek     a  3  GABA A receptory = heteropentamery  navzájem se kombinují  a  podjednotky  nejčastější podjednotková kombinace v CNS =   teoreticky téměř 2000 různých GABA A receptorových kombinací  nejčastější podjednotkou je pravděpodobně  1, komplementární zpravidla podjednotka  3   2 podjednotka zejména v regionech, kde je  1 méně četná (hippokampus, striatum, čichový lalok)   6 podjednotka je exprimována téměř výlučně v mozečku

34 GABA A -  (GABA A rhó) nebo také GABA C receptory jsou podtřídou ionotropních GABA receptorů. Jde s největší pravděpodobností o homopentamerické receptory složené z  podjednotek, které tvoří tři receptorové subtypy. Byla prokázána také heterokombinace s   podjednotkou GABA A Rs. V CNS se v podstatě nevyskytují, převládají v horizontálních a bipolárních buňkách sítnice.

35 Farmakologie GABA A receptorů Farmakologie GABAA Rs se odvíjí od 70. let, kdy badatelé experimentálně zjistili, že křeče navozující alkaloid bikukulin antagonizuje určité inhibiční působení GABA (toto pozorování mj. vedlo i postulování GABA jako hlavního inhibičního neuropřenašeče). Farmaka se na GABA A Rs váží na různých místech: kompetitivní antagonisté a kompetitivní agonisté se obvykle váží na vazebné místo pro GABA, které obvykle leží na  podjednotkách. Látky okupující vazebné místo pro GABA: bikukulin další kompetitivní antagonisté jako pitrazepin křeče navozující securinin steroidový analog RU5135 pyridazinylový derivát gabazin dále selektivní agonisté muscimol, isoguvacin, THIP (4,5,6,7- tetrahydroisoxazolo[5,4-c]-pyridon) nebo piperidin-4-sulfonovou kyselinu Látky okupující vazebné místo poblíž chloridového póru silné konvulsanty fenylentetrazol a pikrotoxin (a příbuzný pikrotixinin)  brání toku chloridových iontů.

36 GABA a antagonisté GABA A Rs

37 Benzodiazepinov é (BZD) vazebné místo  účinek benzodiazepinů (BZD) prokázán už počátkem 70. let  BZD potencují GABAergní inhibiční transmisi přímo vazbou na GABA A receptory  benzodiazepinové místo leží jinde než vazebné místo pro GABA  a je čistým allosterickým modulačním místem na GABA A Rs pentameru   podjednotka není přímo součástí vazebného místa pro BZD, ale je pro jeho zformování nezbytná  látky vážící se na BZD místo jsou plní agonisté až plní inverzní agonisté  zvyšují (agonisté) afinitu GABA A Rs k vazbě GABA do jejího vazebného místa a tím zvyšují frekvenci otevírání chloridového kanálu, nebo ji naopak snižují (antagonisté)  mezi agonisty na BZD vazebném místě patří anxiolytika diazepam, chlordiazepoxid, lorazepam a alprazolam  inverzní agonisté mají tendence způsobovat křeče (inhibice inhibice!) či úzkostné stavy a patří mezi ně látky jako  -karbolin nebo  -CCE  antagonisté jako flumazenil se váží do BZD místa, ale sami funkci GABAA Rs nemění; blokují ovšem funkci agonistů či inverzích agonistů  antagonisté používáni při terapii předávkování benzodiazepinovými agonisty Odpověď GABA A Rs na vazbu látek do BZD se velmi liší podle receptorového složení. Mnoho těchto farmak vyvolává a x -podjednotka specifický efekt, což vede k zajímavým klinickým výstupům. diazepam

38 Barbituráty  pentobarbital a fenobarbital; fenobarbital byl používán jako antikolvunsant již zkraje 20. století  zvyšují dobu otevření chloridového kanálu a maximalizují možnost toku chloridů do buňky  senzitivita buňka k barbiturátům není ovlivněna podjednotkovým složením GABA A Rs  podobným mechanismem pravděpodobně účinkují i neuroaktivní steroidy – allostericky regulují funkci GABA A Rs ve smyslu zvýšení či snížení chloridové propustnosti Ethanol  prodlužuje dobu otevření chloridového kanálu a facilituje schopnost GABA aktivovat receptor   2 podjednotky, které se vyskytují při alternativním sestřihu v kratší a delší variantě, ovlivňují citlivost receptorového komplexu k ethanolu  ethanol zesiluje účinek GABA jen v receptorech obsahujících delší formu  2 podjednotky. Tato sestřihová varianta obsahuje i sekvenci pro fosforylací proteinkinasou C; pokud je poškozena, receptor svou sensitivitu k ethanolu ztrácí !!! ethanol, BZD a barbituráty působí podobným mechanismem na stejném receptorovém substrátu  současné užívání těchto látek způsobuje klinické komplikace !!!  farmakologický synergismus zvyšuje možnost předávkování a může vést ke vzniku křížové závislosti Sedativa, hypnotika či anestetika na GABA A R

39 Při alkoholovém detoxu jsou pak BZD lékem volby: bývají užity k potlačení abstinenčních příznaků jako halucinací, deliria tremens a křečí. Dlouhodobé užívání BZD vede k toleranci některých jejich účinků, zejména se snižuje jejich protikřečový a sedační efekt, takže jejich dlouhodobé užití v terapii nespavosti či epilepsií je limitováno. Kupodivu, tolerance k anxiolytické složce jejich účinku nevzniká. Tato tolerance pravděpodobně vzniká expresí podjednotek bez BZD vazebného místa, pokud jsou benzidiazepinová farmaka užívána dlouhodobě. Na GABA A Rs působí také inhalační anestetika. Jejich vazebné místo se typicky vyskytuje poblíž extracelulární oblasti transmembránových segmentů M2 a M3. Mezi tyto látky patří např. enfluran. Jak už jsem zmiňovala, některá farmaka působící na GABAA Rs vyvolává  x - podjednotka specifický efekt, což vede k zajímavým klinickým výstupům. Antagonista BZD vazebného místa nazvaný RO působí jen na GABA A Rs obsahujících   podjednotku. Ta je koncentrována v mozečku a RO redukuje ataxii navozenou ethanolem, aniž by měnil další účinky ethanolu. Na GABAA Rs obsahujících   podjednotku působí zolpidem, non-BZD sedativum, které se váže do BZD místa GABA A receptorů. Farmakologové se snaží vyvíjet ligandy GABA A receptorů, jež by nespouštěly vznik závislosti a na které by nevznikala dlouhodobá tolerance.

40  GABA B receptory původně identifikovány díky své schopnosti vázat bikukulin a další ligandy GABA A receptorů.  až později se začalo pracovat s GABA analogem a svalovým relaxantem baklofenem (silný agonista GABA B receptorů)  metabotropní receptory spřažené s G-proteiny třídy G i  lokalizovány presynapticky i postsynapticky  obsahují typických 7 transmembránových segmentů  větší než většina receptorů spřažených s G-proteiny, jejich délka je aminokyselin. Strukturně jsou podobny mGluRs. Byly naklonovány dvě hlavní skupiny GABA B receptorových podjednotek: GABA B R 1a a R 1b. Obě jsou spřaženy s G i proteiny.  vyklonována i podjednotka GABA B R2 schopná heteromerizace s ostatními podjednotkami ve funkční receptor. Toto byl první příklad receptoru spřaženého s G- proteinem, který funguje jako multimerický komplex. Účinky GABA B receptorů zahrnují zejména otevírání draslíkových kanálů pokles vápníkové vodivosti a inhibici adenylylcyklasy. GABA B receptory

41 Neurology 2012 vol. 78 no. 8 pg

42  ve srovnání s GABA A receptory navozují GABA B receptory odpověď s pomalejším nástupem, ale delší dobou trvání  odpověď vyvolaná GABA B receptory ale vyžaduje stimulus o větší síle a delší době trvání než v případě GABA A receptorů, což je možná dáno tím, že jsou lokalizovány i extrasynapticky  GABA A receptory leží na synapsi přímo proti místu výlevu a k aktivaci jim teoreticky stačí uvolnění jediného kvanta GABA, zatímco ke stimulaci receptorů extrasynaptických se musí uvolnit GABA tolik, aby k nim dodifundovala  presynaptické GABA B Rs = autoerceptory inhibující další výlev GABA z GABAergního nervového zakončení  pokud jsou GABA B receptory lokalizovány na excitačních nervových zakončeních, vede jejich stimulace ke poklesu výlevu glutamát  mohou inhibovat také výlev dalších neuropřenašečů jako noradrenalinu, dopaminu, serotoninu či substance P. Ve všech případech dochází k této inhibici snížením vodivosti Ca 2+ kanálů a poklesem vtoku vápníku do zakončení. Na inhibici se může spolupodílet i zvýšená vodivost pro draslík. Přehled selektivních ligandů GABA B Rs máte v doprovodném textu. Obecně je využíván např. baklofen v terapiích vedoucích ke snižování spasticity, v budoucnu snad budou dostupná farmaka použitelná v terapii úzkosti, křečí či deprese.

43 Glycin  většina glycinu v CNS savců je syntetizována de novo z glukosy přes serin  serin je následně konvertován na glycin enzymem serinhydroxymethyltransferasou (SHMT), což je enzym pyridoxalfosfát- dependentní. (Pyridoxalfosfát je derivát vitamínu B 6.) Tato konverze probíhá s největší pravděpodobností v mitochondriích - distribuce mitochondriální SHMT kopíruje distribuci glycinu.  inhibiční neuropřenašeč, který se účastní neurotransmise převážně v mozkovém kmeni a páteřní míše  degradace glycinu se děje převážně cestou systému štěpení glycinu (glycine cleavage system, CGS), který zahrnuje 4 enzymy  CGS je lokalizován na vnitřní mitochondriální membráně a jeho poruchy způsobují skupinu metabolických onemocnění souhrnně označovaných jako nonketotické hyperglycinemie  typická je pro ně vysoká koncentrace glycinu v CSF

44 Uvolňování a zpětné vychytávání glycinu  ze synaptické štěrbiny je zpětně vychytáván transportéry lokalizovanými na membráně přilehlých glií, stejně jako na membráně presynaptického zakončení  proti svému koncentračnímu gradientu je zpět do buněk přenášen pomocí kontransportu se 2 Na + a 1 Cl -  transport je tedy elektrogenní a vede k vtoku kladného náboje do buňky Dvě skupiny glycinových transportérů: GLYT1 a GLYT2 GLYT1  existuje ve třech variantách vzniklých alternativním sestřihem  nejsou známy rozdílné transportní charakteristiky těchto transportérů, ale byla popsána jejich různá distribuce v rámci CNS  jen GLYT1 transportér je -oproti GLYT2- citlivý k sarcosinu (N-methylglycinu)  oba typy transportérů jsou lokalizovány v kaudální části CNS  GLYT1 je exprimován i v těch málo oblastech koncového mozku, které souvisí s glycinergní transmisí  tam reguluje GLYT1 NMDA glutamátové receptory: glycin je jejich allosterický modulátor a GLYT1 upravuje jeho dostupnost (tj. extracelulární koncentraci)  inhibitory GLYT1 transportéru tedy mohou posilovat funkci NMDA receptorů  GLYT1 je exprimován v neuronech i astrocytech, GLYT2 jen v zakončeních glycinergních neuronů

45 Glycinové receptory (Gly Rs)  primárně se vyskytují v mozkovém kmeni a páteřní míše  formují iontový kanál s propustností pro chloridy  podobné velikosti jako GABA A Rs (okolo 250 kDa) a podobně jako ony s největší pravděpodobností formují pentamerickou strukturu, která obklopuje vodou naplněný pór pro průchod iontů !!! Glycinové receptory nejsou identické s vazebným místem pro glycin na NMDA glutamátových receptorech a farmakologicky je lze odlišit vazbou strychninu !!!  strychnin = selektivní antagonista Gly Rs a silný konvulsant  agonisté Gly Rs jsou kompetitivní a není jich popsáno mnoho  podle potence se řadí obvykle následujícím způsobem: glycin >  -alanin > taurin > L- a D-alanin > L-serin >> D-serin  mezi další agonisty patří např. cykloserin, dimethylglycin, hypotaurin, methylglycin (sarcosin), betain (trimethylglycin) nebo Milacemid  nekompetitivní inhibitory některých Gly Rs se váží přímo na receptorový iontový kanál a blokují tok chloridových iontů. Patří mezi ně např. pikrotoxin a jeho derivát pikrotoxinin. Mezi další antagonisty patří např. bikukulin, kofein, cyanotrifenylborát (CTB), strychnin nebo tutin. strychnin

46  protein složený z několika různých podjednotek  gephyrinová podjednotka na cyto- plamatické straně membrány (vazba Gly R na cytoskelet, 93 kDa)  část Gly R vázající glycin složena z 3 alfa a 1-2 beta podjednotek (58 kDa)  vlastní pór tvoří pět alfa (48 kDa) podjednotek až 3  /2  podjednotky  pór kanálu by neměl mít o moc větší průměr než 5,2 Å (selektivita)  a podjednotky také tvořeny segmenty M1-M4 (podobně jako nAChRs, GABA A Rs – evoluční příbuznost)  propouští Cl - ionty  vazebné místo pro strychnin je na alfa podjednotce Glycinový receptor (Gly s)

47  naklonovány čtyři  podjednotky (geny GLRA1-4) a jedna samotnými  podjednotka  od každé podjednotky jsou známy sestřihové varianty  složení Gly Rs se mění během ontogenese  v krysích embryích byly detekovány výhradně  2 podjednotky Gly Rs  adultní formy GlyRs jsou obvykle heteropentamery složené ze 3   podjednotek a 2  podjednotek.  chloridová vodivost homopetnamerních Gly Rs složených z   podjednotek je výrazně vyšší než u jiných homopentamerů nebo heteromerů: existuje ontogenetický pokles vodivosti Gly Rs způsobený kratší dobou jejich otevření  vzrůst transkripce    podjednotek během vývoje se omezuje jen na infralimbický systém (hippokampus a granulární buněčnou vrstvu mozečku)   podjednotky se kupodivu (resp. jejich mRNA) vyskytují v celém dospělém savčím CNS, ačkoliv tyto podjednotky samotné nemohou zformovat glycinový receptor Glycinové receptory (Gly Rs) Mutace v   podjednotce glycinového receptoru vedou k dominantně děděné chorobě zvané hyperekplexie. Jde o bodovou mutaci v pozic 271 na   podjednotce, která způsobí více než stonásobný pokles afinity receptoru pro glycin. Velmi typický je pro tuto chorobu vysoký svalový tonus. Pacienti vykazují tzv. startle reflex – po neočekávaném taktilním nebo zvukové podnětu „ztuhnou“, kontrahují jim svaly končetin a někdy mrkají.

48 Co si pamatovat z dnešní přednášky  glutamát: receptory, farmakologie  GABA: receptory, farmakologie  glycin: receptory, farmakologie


Stáhnout ppt "Neurochemie: Neuropřenašeče: excitační a inhibiční aminokyseliny (glutamát, glycin, GABA) 3. přednáška."

Podobné prezentace


Reklamy Google