Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Chromatografické metody. Podstata Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami C S = f(C M ). Rovnováha je.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Chromatografické metody. Podstata Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami C S = f(C M ). Rovnováha je."— Transkript prezentace:

1 Chromatografické metody

2 Podstata Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami C S = f(C M ). Rovnováha je neustále porušována a obnovována průtokem mobilní fáze.

3 Chromatografie Cvet – separace chlorofylů na Al 2 O

4 Typy chromatografie Mobilní fáze –kapalina (liquid) – LC –plyn (gas) – GC Stacionární fáze –pevná (solid) – LSC, GSC –kapalná (liquid) – LLC, GLC Uspořádání –sloupec (kolonové), tenká vrstva - TLC Provedení analytické a preparativní

5 Schematický průběh sloupcové chromatografie

6 Chromatogram – eluční profil

7 Retenční – eluční čas t r Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objem V r Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky F m – objemová rychlost mobilní fáze

8 Mrtvý objem V r – zdánlivý retenční objem V r’ - redukovaný (skutečný) retenční objem V m - mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

9 Kapacitní faktor k’ V s – objem stacionární fáze V M – objem mobilní fáze c s – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi c M – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi Distribuční koeficient k’= 1 – 10

10 Účinnost kolony počet teoretických pater N YrYr ½Yr

11 Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H l – délka kolony

12 Účinnost kolony

13 Rozlišení t r1 Y r1 Y r2 R 12 =1.5 – nulové překrytí R 12 =1.0 – překrytí 2 % Y r1 Y r2

14 Síly a efekty využívané při separaci Iontové síly Polární síly Nepolární síly Sterické interakce Efekt velikosti molekul

15 Rozdělovací chromatografie

16 cScS cMcM Použití – analytická PC, TLC

17 Adsorpční chromatografie

18 cScS cMcM

19 Stacionární fáze – polární Silikagel SiO 2. n H 2 O Oxid hlinitý Al 2 O 3, AlO(OH), Al(OH) 3 Hydroxyapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 OH]

20 Adsorpční chromatografie Mobilní fáze – nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky

21 Reverzně fázová chromatografie Stacionární fáze – nepolární C 8, C 18 Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

22 Reverzně fázová chromatografie H2OH2O Použití : analytické – až 90 % analýz Kartáčový typ stacionární fáze

23 Hydrofobní chromatografie Stacionární fáze – - C 8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

24 Ionexová chromatografie

25 + elektrostatická interakce + + Vazba Eluce

26 Ionexy Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO 3 - slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO - Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

27 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH Má pufrační kapacitu pH % COO - COOH

28 Ionexová chromatografie cScS cMcM kapacita ionexu

29 Afinitní chromatografie

30 Afinitní interakce

31 Interakce mezi DNA a endonukleasou

32 Afinitní páry

33 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

34 Afinitní chromatografie vznik interakce

35 Afinitní chromatografie vymytí balastů

36 Afinitní chromatografie eluce

37 Předpoklady pro vznik komplexu Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

38 Předpoklady pro vznik komplexu Vazebné Konformační

39 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

40 Gelová permeační chromatografie

41

42 Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

43 Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Totální permeace Selektivní permeace

44 Gelová permeační chromatografie Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

45 PC a TLC

46 1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena) 1952 – TLC nahrazuje PC

47 Instrumentace PC a TLC

48 Chromatografický papír Nemodifikovaný Modifikovaný – ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)

49 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané Komerčně dostupné - Siluful (Cz) Watman

50 PC a TLC - mody rozdělovací adsorpční ionexová hydrofobní – RP a HIC gelová permeační

51 Nanášení vzorku Pipety Kapiláry

52 Provedení Vzestupné Sestupné Kruhové Dvojrozměrné

53 Vzestupné

54 Sestupné

55 Kruhové

56 Vyvíjení

57 Dvojrozměrné

58 Provedení Analytické Preparativní

59 Analýza kvalitativní standardy vzorky

60 Analýza kvantitativní Planimetrie Denzitometrie Plocha skvrn

61 Denzitometrie

62

63 Preparace PC – vystřižení a eluce skvrny TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny

64 Chromatografie

65 Kapalinová chromatografie rozdělení Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC

66 Kapalinová chromatografie využití LPC – semipreparativní FPLC – semipreparativní a analytická HPLC – analytická

67 Kapalinová chromatografie doba trvání LPC – hodiny FPLC – desítky minut HPLC – minuty

68 Zařízení pro LPC

69 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

70 Instrumentace pro FPLC a HPLC

71 Zařízení pro HPLC

72 Pumpy

73 Tlaková pumpa

74 Lineární dávkovače

75 Pumpa jednopístová

76 Pumpa dvoupístová

77

78 Gradient nízkotlaký

79 Gradient vysokotlaký

80 Dávkování – dávkovací ventil

81 Dávkovací ventil – „Load“

82 Dávkovací ventil – „Inject“

83 Kolona

84 Detektory

85 UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou

86 UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

87 UV – VIS detektor s diodovým polem

88 LC-MS

89 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

90 Provedení Analytické Preparativní

91 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS

92 Analýza kvantitativní  Plocha (výška) píku Metoda externího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda standardního přídavku

93 LC analýza


Stáhnout ppt "Chromatografické metody. Podstata Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami C S = f(C M ). Rovnováha je."

Podobné prezentace


Reklamy Google