Chromatografické metody

Prezentace na téma: "Chromatografické metody"— Transkript prezentace:

1 Chromatografické metody

2 Podstata Distribuce látek mezi dvě fáze - stacionární a mobilní – popsána distribučními izotermami CS = f(CM). Rovnováha je neustále porušována a obnovována průtokem mobilní fáze.

3 Chromatografie Cvet – separace chlorofylů na Al2O

4 Typy chromatografie Mobilní fáze Stacionární fáze Uspořádání
kapalina (liquid) – LC plyn (gas) – GC Stacionární fáze pevná (solid) – LSC, GSC kapalná (liquid) – LLC, GLC Uspořádání sloupec (kolonové), tenká vrstva - TLC Provedení analytické a preparativní

5 Schematický průběh sloupcové chromatografie

6 Chromatogram – eluční profil

7 Retenční – eluční čas tr
Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Retenční – eluční objem Vr Objem mobilní fáze proteklý od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky Fm – objemová rychlost mobilní fáze

8 Mrtvý objem Vr – zdánlivý retenční objem
Vr’- redukovaný (skutečný) retenční objem Vm- mrtvý objem – mimokolonové příspěvky + mimočásticový objem kolony

9 Kapacitní faktor k’ k’= 1 – 10 Vs – objem stacionární fáze
VM – objem mobilní fáze Distribuční koeficient cs – rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi cM – rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi

10 Účinnost kolony počet teoretických pater N
Yr ½Yr

11 Účinnost kolony výškový ekvivalent teoretického patra H
l – délka kolony

12 Účinnost kolony

13 Rozlišení Yr1 Yr2 tr1 tr1 R12=1.5 – nulové překrytí
R12=1.0 – překrytí 2 % Yr1 Yr2 Yr1 Yr2

14 Síly a efekty využívané při separaci
Iontové síly Polární síly Nepolární síly Sterické interakce Efekt velikosti molekul

15 Rozdělovací chromatografie

16 Rozdělovací chromatografie
cS cM Použití – analytická PC, TLC

17 Adsorpční chromatografie

18 Adsorpční chromatografie
cS cM

19 Adsorpční chromatografie
Stacionární fáze – polární Silikagel SiO2 . n H2O Oxid hlinitý Al2O3, AlO(OH), Al(OH)3 Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3OH]

20 Adsorpční chromatografie
Mobilní fáze – nepolární Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze Eluotropická řada: uhlovodíky<subst.uhlovodíky<ketony< aldehydy<alkoholy<voda

21 Reverzně fázová chromatografie
Stacionární fáze – nepolární C8, C18 Mobilní fáze – polární – vodné roztoky pH  potlačit disociaci Eluce – snižováním polarity mobilní fáze ACN, MetOH,

22 Reverzně fázová chromatografie
Kartáčový typ stacionární fáze H2O Použití : analytické – až 90 % analýz

23 Hydrofobní chromatografie
Stacionární fáze – - C8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky 1.7 M (NH4)2SO4 Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace bílkovin

24 Ionexová chromatografie

25 Ionexová chromatografie
elektrostatická interakce Vazba + Eluce + +

26 Ionexy Katexy - - vazba kationtů
silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO- Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(DEAE) slabé – trietylaminoetyl(TEAE)

27 Slabý ionex Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH
Má pufrační kapacitu COO- % COOH pH

28 Ionexová chromatografie
cS cM kapacita ionexu

29 Afinitní chromatografie

30 Afinitní interakce

31 Interakce mezi DNA a endonukleasou

32 Afinitní páry

33 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

34 Afinitní chromatografie vznik interakce

35 Afinitní chromatografie vymytí balastů

36 Afinitní chromatografie eluce

37 Předpoklady pro vznik komplexu
Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

38 Předpoklady pro vznik komplexu
Vazebné Konformační

39 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla
Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

40 Gelová permeační chromatografie

41 Gelová permeační chromatografie

42 Gelová permeační chromatografie
Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

43 Gelová permeační chromatografie
Totální exkluse Selektivní permeace Totální permeace

44 Gelová permeační chromatografie
Nanášení vzorku – objem vzorku < 2% objemu kolony Eluce – izokratická Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

45 PC a TLC

46 PC a TLC 1944 – Martin, Snyge - PC aminokyselin (Nobelova cena)
1952 – TLC nahrazuje PC

47 Instrumentace PC a TLC

48 Chromatografický papír
Nemodifikovaný Modifikovaný – ionexy, acylace f. Watman (Anglie) Schleicher-Schüll (Německo)

49 TLC Vlastní příprava - sypané, nalévané
Komerčně dostupné - Siluful (Cz) Watman

50 PC a TLC - mody rozdělovací adsorpční ionexová hydrofobní – RP a HIC
gelová permeační

51 Nanášení vzorku Pipety Kapiláry

52 Provedení Vzestupné Sestupné Kruhové Dvojrozměrné

53 Vzestupné

54 Sestupné

55 Kruhové

56 Vyvíjení

57 Dvojrozměrné

58 Provedení Analytické Preparativní

59 Analýza kvalitativní standardy vzorky

60 Analýza kvantitativní
Planimetrie Denzitometrie Plocha skvrn

61 Denzitometrie

62 Denzitometrie

63 Preparace PC – vystřižení a eluce skvrny
TLC – vyškrábání a eluce skvrny – odsání a eluce skvrny

64 Chromatografie

65 Kapalinová chromatografie rozdělení
Nízkotlaká (atmosferický tlak) – LPC Střednětlaká (4 Mpa) – FPLC Vysokotlaká (40 Mpa) – HPLC

66 Kapalinová chromatografie využití
LPC – semipreparativní FPLC – semipreparativní a analytická HPLC – analytická

67 Kapalinová chromatografie doba trvání
LPC – hodiny FPLC – desítky minut HPLC – minuty

68 Zařízení pro LPC

69 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace
Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

70 Instrumentace pro FPLC a HPLC

71 Zařízení pro HPLC

72 Pumpy

73 Tlaková pumpa

74 Lineární dávkovače

75 Pumpa jednopístová

76 Pumpa dvoupístová

77 Pumpa dvoupístová

78 Gradient nízkotlaký

79 Gradient vysokotlaký

80 Dávkování – dávkovací ventil

81 Dávkovací ventil – „Load“

82 Dávkovací ventil – „Inject“

83 Kolona

84 Detektory

85 UV – VIS detektor s fixní vlnovou délkou

86 UV – VIS detektor s proměnlivou vlnovou délkou

87 UV – VIS detektor s diodovým polem

88 LC-MS

89 Vyhodnocení Zapisovače Integratory Integrační software + PC

90 Provedení Analytické Preparativní

91 Analýza kvalitativní Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů „spiking“ – přidání standardu do vzoru  nárůst výšky píků Specifická detekce – UV-VIS, fluorescence, elektrochemická MS

92 Analýza kvantitativní
 Plocha (výška) píku Metoda externího standardu Metoda vnitřního standardu Metoda standardního přídavku

93 LC analýza