Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Imunologická diagnostika Anti-infekční imunita - bakteriální, virov á, mykotická onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Imunologická diagnostika Anti-infekční imunita - bakteriální, virov á, mykotická onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie)"— Transkript prezentace:

1 Imunologická diagnostika Anti-infekční imunita - bakteriální, virov á, mykotická onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie) Hypersensitivní reakce (alergie) Imunodeficity Autoimunitní onemocnění Onkologická hemagologická onemocnění Protinádorová imunita Základní přístupy: Co nejvyšší stupeň automatizace: analyzátory – protilátky, antigeny Moderní sofistikované metody: průtoková cytometrie Funkční testy lymfocytů: obtížně automatizovatelné

2 Laboratorní diagnostika v imunologii - hlavní metody Stanovení sérových komponent a protilátek - imunochemické metody Diagnostika autoprotilátek - fluorescenční metody Typizace imunokompetentních buněk - průtoková cytometrie Funkční testy imunokompetentních buněk - průtoková cytometrie

3 Zastoupení jednotlivých metod

4 Rutinní laboratoř Ústavu imunologie FN Motol Celkově Počet RČ Celkový počet vyš Počet pacientů Počet vyš. za 1 den Počet vyš. u 1 pac.6,976,817,03

5 Precipitační imunochemické metody Reakce založené na měření množství imunitních komplexů vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem. Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti tvorby nebo hustotě zákalu. Detekce s využitím rozptylu světla Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že disperzní soustava se při průchodu světla jeví zakalená. Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi se světelné paprsky mohou od částic odrážet Stanovení bílkovin séra na analyzátorech – turbidimetrie, nefelometrie

6 Turbidimetrie a nefelometrie Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném poměru s odpovídající protilátkou, vytvoří se precipitát. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v r Heidelbergem a Kendallem Po průchodu světelného paprsku suspensí imunitních komplexů dochází k poklesu jeho intenzity v důsledku rozptylu, absorpce a odrazu. Pokles intenzity paprsku je úměrný množství imunitních komplexů v roztoku.

7 Turbidimetrie a nefelometrie

8 Turbidimetrie Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu) Stupeň zákalu – turbidita Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a rozptylující vrstvou. Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým světlem ( nm) Nefelometrie Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou délkou dopadajícího světla Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu světla, která je přímo úměrná rychlosti vzniku IK – Ag-Ab O řád citlivější než turbidimetrie (µg/ml)

9 Praktické aplikace IgA, IgG, IgM, IgD, podtřídy volné řetězce kappa, lambda reaktanty akutní fáze (CRP, haptoglobin, orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa 2 makroglobulin) koagulační faktory, složky komplementu Léky (např. antibiotika) Finanční nákladnost – cca 100.-Kč/vzorek Příklady analyzátorů – Beckman, Olympus

10 Neprecipitační imunochemické metody používané v imunologické laboratorní diagnostice Základní princip = rekce antigen-protilátka označení Ag nebo Ab značkou Enzym Fluorochrom Luminofor Radioaktivní zářič

11 precipitace - 30  g/ml aglutinace - 1  g/ml Neprecipitační imunochemické metody: RIA, FIA, LIA, EIA - 1 pg/ml Citlivost kvantitativního stanovení antigenu/protilátky:

12 Rozdělení metod podle použitého značení Radioaktivní Enzymatické Fluorescenční Luminiscenční

13 Enzymová Immunoassay (EIA) Označení antigenu nebo protilátky enzymem Nejpoužívanější: křenová peroxidáza (HRP) alkalická fosfatáza (AP) Chromogenní substráty - barevný produkt - kolorimetrická detekce - spektrofotometrie HRP: tetramethylbenzidin (TMB) nebo o- fenylendiamin AP: 4-nitrofenylfosfát

14 Heterogenní enzymová assay – ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Dnes nejběžnější typ imunoanalýzy v imunologických laboratořích Antigen nebo protilátka jsou imobilizovány na pevný povrch – plastové mikrotitrační destičky Stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek přímá úměra mezi koncentrací analytu a aktivitou enzymu

15 Sandvich ELISA Standardní ELISA na zjištění koncentrace antigenu navázání protilátky na pevnou fázi (polystyrén) přidání vzorku a inkubace – dochází ke vzniku vazby antigen- protilátka odmytí nenavázaného antigenu přidání druhé protilátky, vážící stejný antigen, na které je kovalentně navázán enzym inkubace a odmytí nadbytečné protilátky s enzymem přidání substrátu a průběh enzymem katalyzované reakce – barevný produkt

16 Capture ELISA Modifikace na detekci protilátek ve vzorku v 1. kroku navázán na pevnou fázi antigen druhá protilátka je namířena proti hledané protilátce (např. anti-Human IgG)

17 Výsledky imunoanalýzy kvalitativní Jediný kalibrační bod („cutoff“ bod) Výsledky jsou buď ‘pozitivní’ nebo ‘negativní’; (tj. nad nebo pod hodnotou cutoff) kvantitativní Vztah mezi naměřenou hodnotou a koncentrací zkoumané látky určen z kalibrační křivky (obvykle 5 – 6 bodů)

18 Využití ELISA metod Imunologický výzkum humánní i veterinární diagnostika Příklady : HIV-1 and HIV-2 (přítomnost anti-HIV protilátek) hepatitis C, B (přítomnost Ab i Ag) hormony (HCG, LH, TSH, T3 atd) stanovení protilátek po očkování (tetanus, dětské nemoci) cytokiny (interleukiny, TNF, EPO,atd.) alergeny autoprotilátky (RF, ENA, ANA) toxiny drogy

19 LIA (CLIA) ChemiLumminiscence Immuno Assay Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po přidání syntetizovaného činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence) luminiscenční značka – chemiluminofor luminol, izoluminol (aktivace přidáním H 2 O 2 ) luciferáza - luciferin citlivost je vyšší než u RIA (záblesky světla - detekce světla)

20 FLUORESCENČNÍ METODY Reakce Ag-Ab, detekce antigenů Protilátka je označená fluorochromem Možnost použití více protilátek s různými fluorochromy Detekce fluorescenčním mikroskopem (tkáně) Detekce průtokovou cytometrií (suspenze buněk)

21 Metody detekce autoprotilátek Fluorescenční mikroskopické metody (nepřímá fluorescence) ANA, AMA, SMA, ScMA, GPC, LKM, ANCA, EMA, AECA, dsDNA, GBM ELISA - vyšetření např. ENA- screen, ENA-typizace, kardiolipin, RF, gliadin, transglutamináza, ANCA

22 Průtoková cytometrie Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie

23 Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“ Odpad Detekce & Počítání Vzorek Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence Nevýhoda oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky

24 Fluidika: vzorek – buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci Části průtokového cytometru

25 Schéma fluidiky Unášecí tekutina Odpad Natlakování Vakuum Tlak Vzorku (Variabilní) Tlak unáš. tek. (Stálý) vzorek

26 Hydrodynamická fokusace - Proud buněk (sample stream) je unášen obalem hnací kapaliny (sheath fluid) - Zajišťuje se tak zúžení vzorkového proudu do tenkého paprsku, buňky se řadí jednotlivě za sebou. - Buňky v tenkém paprsku protínají laserový svazek a vzniká pulz.

27 Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit Princip průtokové cytometrie Quartz nozzle Fluorescenční signály Laserový paprsek Nasátí buněk Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta

28 Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) FSC Detektor Laserový paprsek Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla FSC závisí na velikosti buňky

29 Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) FSC Detektor Sběrné čočky SSC Detektor Laserový paprsek Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky

30 Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC FSC SSC Lymfocyty Monocyty Granulocyty Erytrocyty debris, Mrtvé buňky

31 Detekce fluorescence, značení protilátkami

32 Typizace buněk – CD znaky molekuly na povrchu krevních buněk fenotypizace leukocytů Číslovány podle mezinárodní CD nomenklatury od r CD = cluster of differentiation Dnes známo 363 antigenů

33 Detekce Fluorescence FSC Detector CollectionLens Laser Beam Fluorescence Detector A, B, C, etc… Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém z nich vyhodnocena intenzita fluorescence.

34 Základní konstrukce cytometru. - Buňky v suspenzi s navázanou protilátkou(ami) prochází svazkem(y) laseru(ů) jedna po druhé. - Měří se rozptyl světla v kolmém (SSC) a rovnoběžném (FSC) směru. - Dále fluorescence v kolmém směru. - Pro každou částici je zachycen a dále zpracován pulz rozptylu i fluorescencí ve všech sledovaných kanálech.

35 Intenzita fluorescence FITC Relative fluorescence intensity Number of Events FITC

36 Vícebarevná průtoková cytometrie FACS Aria

37 Vícebarevná průtoková cytometrie FITCPEAPCPC7PC5Pacific blue

38 Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) Stejná excitace různá emise Překryv spekter (overlap)

39 Mnohobarevná cytometrie Výhody Šetří čas a vzorky (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek Exponenciální nárůst informace Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) interní kontroly ve vzorku Problémy Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách Vyšší možnost vzniku chyb Je potřeba zvolit správné kontroly

40 Analýza a interpretace dat Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení Různé typy grafů Statistiky Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo, WinMDI, FCS Express)

41 Histogram – zobrazení jednoho parametru Event # Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 FITC Param 4 PE Param 5 APC ………10………100………1000…… LIST MODE FILE Četnost (count) Intenzita signálu

42 Dot plot – zobrazení dvou parametrů FSC SSC Periferní krev – populace dle velikosti a granularity 30% 60% Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8

43 Gatování Gate je definován jako oblast Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: procento pozitivních buněk Hodnota fluorescence (relativní hodnota) Populace krevních dendritických buněk

44 Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) Analýza proliferace (CFSE) Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) DNA a RNA analýza Sorting a buněčná izolace

45 Stanovení zastoupení základních buněčných populací Periferní krev CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty CD16+CD56+ NK buňky CD19+ B lymfocyty

46 Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza – fosfatidylserin na vnější straně membrány – vazba Annexinu V Mrtvé buňky - Průnik barvy do jádra (PI nebo DAPI)

47 Oxidační reakce SuperoxideHydroethidine Hydrogen PeroxideDichlorofluorescein Glutathione levelsMonobromobimane Nitric OxideDichlorofluorescein Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.

48 Testování fagocytózy Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC (zelená) 24 hodControl 0°C4 hod


Stáhnout ppt "Imunologická diagnostika Anti-infekční imunita - bakteriální, virov á, mykotická onemocnění Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie)"

Podobné prezentace


Reklamy Google