Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Epigenetika - metylace DNA. Metylace DNA u Eukaryot nemetylovaná DNA : kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Epigenetika - metylace DNA. Metylace DNA u Eukaryot nemetylovaná DNA : kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice."— Transkript prezentace:

1 Epigenetika - metylace DNA

2 Metylace DNA u Eukaryot nemetylovaná DNA : kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice Caenorhabditis savci: 3-8 % cytosinových zbytků, CG sekvence (u embryonálních kmenových buněk i v non-CG kontextu) - nízký výskyt CG v repetitivních heterochromatinových oblastech (mutageneze) rostliny : % cytosinových zbytků (~ velikosti genomu) - především v repetitivních heterochromatinových oblastech (pravidelný výskyt nemetylovaných míst – SAR, MAR) - u větších genomů (obiloviny) ostrovy transkripčně aktivní DNA s nižším obsahem metC - metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích exprimovaných genů!!!

3 Mechanismus metylace DNA - metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie – restrikce cizorodé DNA) u Eukaryot je biologicky významná metylace cytosinu na C5 purinového kruhu (u savců i hydroxymethylC) N N N H C*C* H O CH 3 5-methyl cytosine N N N H C H O cytosine + SAM N N O H T O CH 3 thymine + H 2 O - NH 3 „horký bod mutageneze“

4 Metylace DNA – cílové sekvence - symetrické (palindromatické), polosymetrické i nesymetrické sekvence: 5’ CG CHG C---C------G--C---- 3’ 3’ GC GDC G---G------C--G---- 5’ Symetrické sekvence – snadné udržování při replikaci hemimetylovaný stav je signálem pro udržovací metylaci ----C * G C * HG C * C * G G C G DC G G C * CG CHG C GC * GDC * G Asymetrické sekvence – nutno neustále metylovat de novo (principielně je ale také udržovací, pokud byla na mateřském vlákně) - signál: metylace histonů a sRNAs (H = A, T nebo C; D = A,T,G)

5 Preferenční metylace exonů – souvislost s preferenčním výskytem nukleozómů na exonech (spoludefinování přechodu intron – exon a exon – intron) (současně zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždění nukleozómem) - bránění inkorporaci H2A.Z Preferenční výskyt metC na vnější straně nukleozómů - souvisí s preferenčním výskytem C-G na vnější straně (stérické důvody) - lépe přístupný pro metyltransferázy Cílová místa metylace DNA v chromatinové struktuře/sekvenci

6 Předpokládaná korelace přítomnosti H2A.Z, metylace DNA a regulovatelnosti/míry exprese Coleman-Derr and Zilberman metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z - H2A.Z nevhodný/neumožňuje stabilní expresi (house-keeping genů) ( )

7 Analýzy metylace DNA Přímé (strukturní): - spektrofotometrie, HPLC (celkový stav) - %metC - anti metC protilátky (na chromozómu …) - lokalizace metC bohatých úseků chromozómů - pomocí restriktáz citlivých k metylaci - detekce metC v konkrétním restrikčním místě - hydrogensiřičitanovým sekvenováním - přesné určení C a metC v určité sekvenci - i v celém genomu (v kombinaci s moderními technikami sekvenování) Nepřímé (funkční) – vztah mezi metylací a genovou expresí - např. sledování reaktivace umlčených genů

8 Analýzy metylace DNA pomocí restrikčních endonukleáz citlivých k metylaci - štěpení, Southernova hybridizace - PCR, elektroforéza (méně spolehlivé) ( izolace krátkých na geny bohatých fragmentů u velkých genomů - kukuřice) A C CGG CmetCGG C CGG B C CGG C CGG C CGG štěpení restriktázou citlivou k metylaci cílové sekvence PCR primer elektroforéza a Southern PCR a elektroforéza A B

9 Analýzy metylace DNA 1.hydrogensiřitanová modifikace, 2.shotgun sequencing nebo PCR + sekvenace 1. denaturace C*C* C* C CC---C*------C C-- 2. modifikace Cyt na Ura (5metC zůstává nezměněn) C*C* C* U UU---C*------U U-- 3. PCR, sekvenace (WGS) původní sekvence CC C C CC---C------C C G G GG---G------G G-- modifikovaná sekvence CC C U UU---C------U U G A AA---G------A A--

10 Analýza metylace u Arabidopsis „Chromosome epigenetic landscape“ ? ?

11 Mutace zprostředkované metylací C C T met C G T G C G T A Možná role v evoluci genů: - zdvojení sekvencí (např. po polyploidizaci) navodí metylaci - metylace navodí reversibilní inaktivaci - mutace metC může navodit irreversibilní inaktivaci - kopie genu může být postupně masivně mutována (bez selekčního tlaku) - vznik a reaktivace genu s novou funkcí replikace reparace

12 Feature Value DNA molecule Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5SUM Length (bp) Top arm (bp) Bottom arm (bp) Base composition (%GC) Overall Coding Non-coding Number of genes Gene density (kb per gene ) Average gene Length (bp) Average peptide Length (bp) Exons Number Total length (bp) Average per gene Average size (bp) Number of genes With ESTs (%) Number of ESTs 29,105,111 14,449,213 14,655, , , ,482 8,772, ,522 19,646,945 3,607,091 16,039, , , ,631 5,100, ,989 23,172,617 13,590,268 9,582, , , ,570 6,654, ,732 17,549,867 3,052,108 14,497, , , ,073 5,150, ,605 25,53,409 11,132,192 14,803, , , ,226 7,571, , ,409,949 25, ,982 33,249, ,773 Genom Arabidopsis - statistika

13 Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy - 3 rodiny u Arabidopsis MET1 (metyltransferase) CMT3 a CMT2 (chromomethyltransferase) DRM2 (a DRM1) (domain rearranged methyltransferase)

14 MET1 (metyltransferase1) - příbuzná savčí Dnmt1 - udržovací metylace symetrických CG - asociovaná s replikací - spoluúčast komplexu remodulujícího nukleosómy DDM1 (u heterochromatinových sekvencí) Signál – hemimetylovaná CG sekvence ----C * G C * HG C * C * G G C G DC G G C * CG CHG C GC * GDC * G

15 CMT3 (chromomethyltransferase3) - unikátní pro rostliny a houby (příbuzné savčím Dnmt1, ale navíc obsahují chromodoménu = doménu interagující s metK histonu - asociovaná především s konstitutivním heterochromatinem (repetitivní sekvence, TE - retrotranspozóny) - „udržovací“ metylace sekvencí CHG - zřejmě kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 - (interakce zprostředkovaná chromodoménou) ----C * G C * HG C * C * G G C G DC G G C * CG CHG C GC * GDC * G

16 CMT2 (chromomethyltransferase2) - příbuzná CMT3, rovněž obsahuje chromodoménu - asociovaná s konstitutivním heterochromatinem - „udržovací“ metylace sekvencí CHH - kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein) Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 – (interakce zprostředkovaná chromodoménou) ----C * G C * HG C * C * G G C G DC G G C * CG CHG C GC * GDC * G

17 DRM2 a 1 (domain rearranged methyltransferase) - příbuzné savčím Dnmt3, ale mají přeskupené domény - DRM1 – v časné fázi vývoje semen -„udržovací metylace“ asymetrických sekvencí CHH (CHG) (euchromatin a okraje heterochromatinu) - regulace genové exprese, silencing - nutná spoluúčast katalyticky neaktivního paralogu DRM3 u Arabidopsis Cílové sekvence jsou určeny přítomností homologních siRNA = RNA-directed DNA Methylation (RdDM) ----C * G C * HG C * C * G G C G HC G G C * CG CHG C GC * GHC * G

18 Udržovací metylace DNA Heterochromatin s histonem H1 - střední části dlouhých TE (kódující sekvence) - nutná účast chromatin remodel. faktoru DDM1 - metylace řízena: H3K9me2 – CMT2, CMT3 (CHH, CHG) metylací – MET1 (CG) Chromatin bez histonu H1 - okraje TE, krátké TE, geny - účast chromatin remodel. faktoru DRD1 - metylace řízena především siRNA (RdDM) – DRM2 (RdDM – iniciována na H3K9me2 a nemetyl. H3K4, viz dále u RNAi) (- metylace CG řízena metylací – MET1)

19 Zemach et al Udržovací metylace transpozónů

20 Demetylace DNA 1) při replikaci s vyloučením aktivity udržovacích cytosin metyltransferáz (a histonových metyláz) 2) DNA glykosylázy (odštěpení metylcytosinu, reparací doplněn cytosin) ROS1 REPRESSOR OF SILENCING – somatické buňky (k demetylaci nutný ROS3 – protein vázající RNA – sRNA ? mRNA) DEMETER-LIKE (DML2, DML3) – somatické buňky DME1 DEMETER – parentální imprinting (endosperm)

21 Demetylace DNA ROS1 REPRESSOR OF SILENCING DEMETER-LIKE (DML2, DML3) (částečně zastupitelné) - aktivní ochrana reg. sekvencí genů (promotorů) před metylací (příp. při řízené modulaci transkripce) - mutace v „demetylačních“ genech se projeví především nárustem metylace v 3’ a 5’ UTR V metylačních (metyltransferázových) mutantech je demetylace utlumena (zpětná vazba). ros1 dml2 dml3 WT metylace rel. nárůst metylace WT

22 Ovlivňování metylace DNA - aplikace 5-azacytidinu – blokování aktivity MET1 - dihydroxypropyladenin (DHPA) – ovlivnění hladiny SAM - (inaktivace genů MET1, DDM1, CMT3, …) Projevy: - různé: žádné až výrazné změny fenotypu (způsobené TE) - pohlavní reverze u knotovky (andromonoecie), fenotyp cycloidea u lnice, …

23 Reaktivace umlčených transgenů 5-azacytidinem - inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC) hemiMet? deMet Nocarová, Fischer, nepubl. + AzaC Demethylated - obnovení často jen přechodné!

24 Stérické důsledky metylace DNA - buněčná interpretace metylace DNA změny na úrovni histonů - posttranslační modifikace histonů - SRA domény: metylace (SUVH family), - Metyl CpG-binding d.: deacetylace (HDAC) - zastoupení různých forem histonů (H2A.Z) změna vazby dalších interagujících proteinů - regulátorů (aktivátorů a represorů) transkripce - proteinů zodpovědných za strukturu/modifikace chromatinu

25 příklad: MBD proteiny (metyl-CpG-binding domain) - rostlinné MBD proteiny nemají TRD (transcription repression domain) - specifita vazby je dána i dalšími interagujícími proteiny - kolokalizace a interakce s DDM1 - AtMBD5 interaguje i s C*HH - MBD proteiny zřejmě interagují s histon modifikujícími proteiny (HDAC = histon deacetylázy) Model komprimace chromatinu vazbou dimerizujícího AtMBD7 proteinu

26 Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantů kyp a cmt3 Autokatalytická smyčka - metylace CHG (CMT3) a metylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE ) - transkripce indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1) ROS1/ ROS3 ??? x DRM2 „co je defaultní“ stav?

27 Metylace DNA a stav chromatinu - přehled - prokázána korelace hypermetylace DNA a hypoacetylace histonů (pozdní replikace DNA) - metylace DNA je dědičným signálem k deacetylaci histonů a kondenzaci chromatinu - obdobné fenotypové změny při potlačení metylace (MET1) a deacetylace histonů (AtHD1) - přítomnost formy histonu H2A.Z se vzájemně vylučuje s DNA metylací !!! (typicky v promotorech house-keeping genů)

28 Metylace DNA a stav chromatinu - di(tri-)metylace H3K9 (KYP) je signálem pro metylaci CHG - metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9 - k demetylaci H3K9 (IBM1) zřejmě dochází v souvislosti s transkripcí Pol II - demetylace DNA prostřednictvím ROS1 vyžaduje RNA vazebný ROS3 (transkripce, malé RNA?) - trimetylace H3K4 je typická pro euchromatin a vzniká v souvislosti s transkripcí Pol II (aktivní DNA)

29 Udržování epigenetického stavu – přehled Neaktivní chromatin - MET 1 – udržovací metylace C*G - KYP (SUVH5,6) – H3K9me2  CMT3 - C*HG (CMT2 – C*HH) - DRM2, (DRM1) – udrž. metylace CHH  komplement. siRNA Aktivní chromatin - IBM1 – demetylace H3K9  transkripce - ROS1/ROS3, DML2, DML3 – demetC  transkripce?, sRNA?

30 Vzájemná provázanost metylace DNA a struktury chromatinu metC = modifikace dvoušroubovice DNA post- translační modifikace a formy histonů vazba interagujících proteinů TF, RNA pol., MBD, …

31 Úloha a projevy metylace DNA - dědičná (mitoticky a částečně i meioticky) modulace transkripce - genové exprese - obranný mechanismus vůči invazní DNA (transpozóny) - regulace genové exprese (ontogeneze, diferenciace a buněčná paměť, reakce na stres) - parentální imprinting - modulace struktury chromatinu (příčina i následek) - časování DNA replikace - regulace homologní rekombinace (meiosa) - definování hranic exon-intron - nástroj evoluce - genomů polyploidních rostlin (rozsáhlé změny metylace) - nových genů (mutageneze pseudogenů)

32 Metylace DNA u Arabidopsis Silná metylace v repetitivních heterochromatinových oblastech v okolí centromery Metylace v kódujících sekvencích genů – u více než 30 % exprimovaných genů (metylace především u genů se stabilní expresí – house keeping) Metylace v promotorech – u méně než 5 % genů (geny s vývojově a pletivově specifickou expresí)


Stáhnout ppt "Epigenetika - metylace DNA. Metylace DNA u Eukaryot nemetylovaná DNA : kvasinka Saccharomyces cerevisiae, octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice."

Podobné prezentace


Reklamy Google