Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Transgenoze: metody transformace rostlin, rekombinace.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Transgenoze: metody transformace rostlin, rekombinace."— Transkript prezentace:

1 Transgenoze: metody transformace rostlin, rekombinace

2 Vnesení genu Vnášená DNA se může začlenit do jaderné či organelové DNA (plastom, chondriom) -pro expresi genu (= tvorba funkčního proteinu či RNA) v jiném organismu jsou nutné regulační sekvence -rozpoznání transkripčním (a příp. i translačním aparátem) v organismu příjemce -umožňují funkční přenosy genů i mezi vzdálenými organismy stabilní dochází / nedochází k integraci vnesené DNA do genomu transientní

3 Promotor: - určuje začátek a směr transkripce - váže transkripční faktory – časově/místně specifická transkripce - konstitutivní x inducibilní: ethanol, teplo, dexametazon, estradiol, … vedlejší účinky, částečná aktivita (leakiness) - původ: rostliny, rostlinné patogeny (viry – JAKÉ?, agrobaktérium) - transkripce ale ovlivněna i místem integrace a stavem chromatinu (TGS)! Transkripce polyA mRNA TERMINÁTOR transkripce = polyA signál Transkripční faktor RNA polymeráza PROMOTOR

4 Translace -stabilita transkriptu (PTGS – polyA, počet kopií, introny) -odlišné využívání kodónů u různých skupin organismů -odlišné užívání kodónů v závislosti na kontextu (nukleozómy) -charakter sekvence před iniciačním kodónem (Kozakové sekvence) přenos genů mezi baktériemi a rostlinami - cílená mutageneze pomocí PCR, … AACAATG terminační kodón kódující sekvence mRNA

5 selekce Princip přípravy transgenních rostlin 1. Transformace jedné somatické buňky (vaječné buňky) transformovaná buňka organogeneze embryogeneze 3. Indukce organogeneze či somatické (zygotická) embryogeneze (často aplikací vhodných regulátorů rostlinného růstu v in vitro podmínkách) vnesení genu 2. Pomnožení transformované buňky (zpravidla za selekčních podmínek) transformovaný kalus

6 Somaklonální variabilita - průvodní jev regenerací de novo (tedy i transformací) Příčiny: pretransformační x posttransformační - somatické mutace (různého typu) - somatické reaktivace TE - epigenetické změny v somatických buňkách - samovolné či indukované při diferenciaci a následné de- a rediferenciaci (např. změny ploidie v důsledku působení růstových regulátorů - synt. auxinů)

7 Optimalizace transformačního protokolu Optimalizace: -rostlinného materiálu -schopnost aktivace buněčného dělení (kalus) -schopnost následné regenerace (!) -genotyp, orgán, vývojové stádium, ošetření … -metody přenosu DNA -selekčního systému

8 Selekční geny - pouze transformované, rezistentní buňky se mohou dělit (a vytvořit rostlinu) - rezistence k antibiotikům (kanamycin, hygromycin) - k herbicidům ( Roundup® - glyphosate, Liberty® - glufosinate) 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntáza, glutaminsyntetáza (produkt selekčního genu buďto degraduje selekční látku, či komplementuje zasaženou buněčnou funkci) - PMI (fosfomanóza isomeráza) – přeměna manóza-6-P na fruktóza-6-fosfát, … Reportérové geny (vizuální selekce transformantů) : - GFP (zelený fluorescenční protein), - glukuronidáza, luciferáza, … Selekce transformovaných buněk (rostlin)

9 Selekční markery genprodukt genuprincip selekce selekční agens nptIIneomycinfosfotransferázakanamycin hpthygromycinfosfotransferázahygromycin dhfrdihydrofolátreduktázarezistence k antibiotiku methotrexát blevazebný protein bleomycinubleomycin catchloramfenikolacetyltransferázachloramfenikol barfosfinotricinacetyltransferázafosfinotricin (glufosinát) EPSP CP4 bakteriální 5-enolpyruvylšikimát- 3-fosfátsyntáza rezistence k herbicidu glyfosát deh1dehalogenázadalapon

10 Metody transformace „Přirozené“ metody via Agrobacterium –modifikace metody: infiltrace (vakuová), floral dip pomocí rostlinného viru –přechodná (transientní) transformace (DNA není začleněna do genomu) Biolistika („particle bombardment“, „microprojectile bombardment“) - modifikace: agrolistika (využití biolistiky a proteinů agrobaktéria) Direct gene transfer – přímé vnesení DNA do protoplastu: elektroporací působením polyethylenglykolu (PEG) Mikroinjekce do buněk

11 Přirozená transformace agrobaktériem (Agrobacterium tumefaciens) půdní baktérie G - (Rhizobiaceae), Ti plasmid „genetický parazitismus“ na dvouděložných rostlinách přenáší několik svých genů do rostlinných buněk v místě poranění –z transformované buňky se tvoří nádor: ipt – isopentenyltransferáza iaaH – indolacetamidhydroláza –transformované buňky tvoří výživné látky (opiny) pro agrobaktérium (nopalin/octopinsyntáza)

12 Přirozená transformace agrobaktériem

13 - geny způsobující vznik nádoru a syntézu opinů odstraněny – využívá se pouze schopnosti agrobaktéria přenášet T-DNA (definovanou hraničními sekvencemi) do rostlinných b. Ti plasmid rozdělen (na dva): T-DNA v malém podvojném (binárním) plasmidu vir geny (zodpovědné za přenos T-DNA) na helper plasmidu in trans) Upravené agrobaktérium Nezbytné sekvence: pro klonování v E. coli počátek replikace, selekční marker pro bakterie pro udržování (přenos) do agrobakteria: počátek replikace (příp. počátek konjug. přenosu) pro přenos do rostliny pomocí agrobakteria hraniční sekvence pro selekci transgenních buněk selekční marker pod „rostlinným“ promotorem Binární transformační vektor

14 Vyštěpení T-DNA hraniční sekvence T-DNA: - nedokonalá přímá repetice 25 bp: LB a RB = right, left border - jednovláknový zlom virD2 (D1/D2 dimer) - vytěsnění ssT-DNA opravnou replikací

15 Agrobakteriální infekce - produkty vir genů indukce exprese vir oblasti v reakci na fenolickou látku (VirA,VirG) štěpení na koncích T-DNA (VirD1, VirD2) tvorba póru pro mezibuněčný přenos (VirB1-11) ochrana T-DNA řetězce před degradací (VirE2) přenos T-DNA do jádra (VirE2 vazba na rostlinný transkripční faktor VIP, VirD2 s NLS vazba na importin KAP-α) cílená proteolýza proteinů T-DNA komplexu před integrací (VirF)

16 Integrace T-DNA do genomu - nehomologní rekombinace (illegitimní) - několik bází mikrohomologie s hraniční sekvencí v místě integrace - delece, přeuspořádání, filler (vyplňující) sekvence - zachována zpravidla pravá hraniční oblast (chrání VirD2 protein) převládající způsob integrace DNA i u přímých metod transformace Alternativně: vytvoření dsT-DNA, navázání komplexu zajišťujícího ligaci do dvojvláknového zlomu DNA

17 Výhody transformace pomocí agrobaktéria poměrně vysoká frekvence stabilní transformace menší počet kopií (menší riziko umlčení exprese RNAi) možnost přenosu delších úseků DNA (až 45 kbp) Způsoby transformace pomocí agrobaktéria prostá kokultivace agrobaktéria s rostlinným pletivem, buněčnou kulturou, protoplasty in vitro infiltrace (vakuová/tlaková) agrobakteria do pletiva inokulace in planta (květenství, listy) pro transformaci jednoděložných rostlin a některých dalších je nutné indukovat vir geny agrobaktéria externě (acetosyringonem)

18 Transformace bramboru pomocí agrobaktéria kokultivace s poraněnými listy agrobaktérium vstup agrobaktéria do pletiva v místě poranění viditelné kalusy 3-4 týdny po transformaci 5-6 týdnů po transformaci mikroskopický kalus

19 Transformace Arabidopsis thaliana inokulace in planta (floral dip) Ponoření květenství s poupaty do suspenze agrobaktéria

20 - cílem transformace je zpravidla vajíčko/vaječná buňka – z něj transformovaná embrya (semena) a následně rostliny transformovaná embrya - modře zbarvený produkt enzymové aktivity glukuronidázy, která byla použita jako reportérový gen Transformace Arabidopsis thaliana pomocí agrobaktéria

21 Agroinfiltrace tabáku (in planta) - předběžné testování exprese transgenů - bez nutnosti práce in vitro - kotransformace s virovým supresorem silencingu (p19) k potlačení PTGS (vnesen GFP gen) se supresorem bez

22 Biolistická (biobalistická) metoda, transformace (Partickle gun, Gene gun) nabalení DNA na zlaté či wolframové kuličky nastřelení na rostlinný orgán, celé rostliny, buněčnou kulturu,... sítko

23 Biolistická metoda transformace nastřelování pomocí podtlaku či přetlaku (kombinace)

24 Biolistická metoda transformace univerzální použitelnost bez druhových limitací možnost transformace organel (plastidů) získání transformovaných rostlin podobné jako po transformaci agrobaktériem zlatá partikule (1  m) chloroplast (5 x 3  m)

25 Transformace chloroplastů - biolistickou metodou - vysoký počet kopií v genomu - vysoké hladiny proteinu - není silencing - možnost cílení do určitého místa – homologní rekombinace - plastidový genom je většinou nepřenosný pylem (pokud se nezačlení do jaderného genomu) Nevýhody: - nejsou eukaryotické posttranslační modifikace - příprava homoplasmických a nechimerických rostlin je časově náročná

26 Transformace chloroplastů Integrace rekombinací – transgen obklopený chloroplastovými sekvencemi Postupná selekce homoplasmických buněk a nechimerických rostlin

27 Agrolistika - varianta biolistiky - 1. plasmid s geny pro proteiny VirD1 a VirD plasmid s hraničními oblastmi T-DNA ohraničujícími transgen a selekční marker - spíše zajímavá kuriozita; nevýhoda - integrace obou konstruktů (= i konstruktu s vir geny) - někdy také (nesprávné) označení postupu, kdy se biolistika použije k poranění buněk před kokultivací s agrobaktériem

28 Virové vektory pro transientní exprese proteinů - episomální - neintegrují se do genomu (= není poziční efekt) - vyšší počet kopií - silná exprese - rychlá akumulace produktu - přirozené supresory silencingu (x PTGS) - systémové šíření rostlinou - často široké hostitelské spektrum

29 Virové vektory pro transientní exprese proteinů původně z Caulimovirů (např. CaMV) - dsDNA genom - možnost sekvenčně modifikovat - až 10 6 kopií na buňku, 3-4 týdny systémová infekce celé rostliny - infekce mechanicky (odřením listu) ALE malá kapacita – inserty do 500 bp (polyhedrální kapsida) a polycistronní transkripty (komplikované úpravy sekvencí) - nevyužívají se v praxi

30 Virové vektory - výhodnější helikální viry (vláknité, tyčkovité), např. TMV -vyšší tolerance vůči větším insertům -umožněno objevem RT - příprava cDNA (možnost sekvenčně modifikovat RNA viry) -často se využívá k primární infekci agrobaktérium nesoucí T-DNA s cDNA viru – virový genom vzniká transkripcí Virové vektory: -substituční (záměna za virový gen např. CP - CaMV) -inserční (vnesený gen je navíc – např. TMV) -modulární (vícekomponentové) – rozdělení na více replikonů (např. TMV, Geminiviry – polyhedrální!)

31 Přímá metoda - transformace protoplastů - odstranění buněčné stěny (bariéra přenosu DNA do buňky) – z mesofylových buněk, buněčných kultur - přenos přes buněčnou membránu podobně jako u živočišných buněk - regenerace buněk (vytvoření BS) a následná de novo regenerace rostlin je problematická (často nemožná) - integrace většího množství kopií - nepřesnost integrace (kopie často zkrácené, přeuspořádané)

32 Přímá metoda transformace protoplastů PEG (polyethylen glykol) možno kombinovat s elektroporací elektroporace podmínky elektroporace (napětí, délka a množství pulsů) závislé na průměru buňky lipozómy umělé lipidové váčky pro přenos DNA ochrana DNA před degradací DNázami přenos DNA do protoplastu fúzí či endocytózou

33 Kotransformace x supertransformace transformace více vektory zároveň x následně (u agrobaktéria možné více T-DNA na jednom vektoru) optimálně každý vektor (T-DNA) nese jiný selekční marker (u kotransformace není nezbytné)

34 Homologní rekombinace – základní funkce crossing over při meiozi (homologní chromozómy) oprava DNA po poškození (sesterské chromatidy) prosté spojení konců DNA (nehomologní rekombinace) – pouhé spojení zatupených volných konců (často delece, translokace,..) – dominantní způsob u rostlin (většiny eukaryot) homologní rekombinace – integrace transgenů u kvasinek a plastidů a Physcomitrelly) – rekombinace mezi dvěma příbuznými sekvencemi – přesná bezchybná oprava (je-li správný „vzor“!) Inkorporace transgenu - ssT-DNA: nehomologní rekombinace (mikrohomologní) - dsDNA: oprava DSB (dvojřetězcový zlom DNA)

35 Homologní rekombinace 1.extrachromozomální rekombinace rekombinace mezi dvěma vnášenými molekulami DNA - holé molekuly DNA i T-DNA komplexy: u rostlin frekvence 1 až 4 % 2. intrachromozomální rekombinace rekombinace mezi dvěma úseky DNA na tomtéž chromozómu - u rostlin frekvence až (není žádoucí) - pravděpodobně složitější mechanismus než u extrachromozomální rekombinace (nutné narušení struktury chromatinu) 3. gene targeting rekombinace mezi vnášenou DNA a cílovým místem na chromozómu (cílení integrace transgenu u kvasinek, plastidů, apod.) zasažený lokus

36 Frekvence homologní rekombinace (při inserci DNA s homologními úseky) poměr homologní/nehomologní rekombinace vyšší rostliny až (vysoká frekvence illegitimní rekombinace je překážkou pro homologní rekombinaci) savci10 -2 až nižší eukaryota (kvasinky, prvoci, vláknité houby)nad 10% mech Physcomitrella patens90% - vliv délky homologní sekvence, ploidie, buněčného typu, fáze buněčného cyklu, …

37 Stimulace přesné integrace transgenu homologní rekombinací: - expresí rekombinačních enzymů (i bakteriálních) - represe či mutageneze genů účastnících se ilegitimní rekombinace, inhibice jejich produktů - vytvořením cílených DSB expresí místně specifické endonukleázy (viz dříve) (integrace i nehomologní rekombinací) nehomologní rekombinací - použitím místně specifických rekombinačních systémů prokaryot a nižších eukaryot (rekombináza/rozpoznávané cílové místo) Cre/lox bakteriofága P1 Flp/frtSaccharomyces cerevisiae R/RSZygosaccharomyces rouxii

38 Místně specifická inzerce transgenu (= GM) - integrace transgenu s homologními koncovými sekvencemi (homologní rekombinací) - integrace nehomologní rekombinací v místě DSB HOMOLOGNÍ REKOMBINACE Místně specifická mutageneze - samovolná reparace (často s lokální delecí) - DNA templátem řízená mutageneze Reparace DSB

39 Cre/loxP - cílená integrace do místa předchozí inzerce - specifické vystřižení selekčního markeru:


Stáhnout ppt "Transgenoze: metody transformace rostlin, rekombinace."

Podobné prezentace


Reklamy Google