Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

1 Úvod do identifikace bakterií Základní biochemické testy Pr ů vodce po cvi č ení Salmonella typhi Proteus Yersinia pestis.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "1 Úvod do identifikace bakterií Základní biochemické testy Pr ů vodce po cvi č ení Salmonella typhi Proteus Yersinia pestis."— Transkript prezentace:

1 1 Úvod do identifikace bakterií Základní biochemické testy Pr ů vodce po cvi č ení Salmonella typhi Proteus Yersinia pestis

2 2 Identifika č ní testy Zkumavkové Mikrotesty – v 1 souprav ě je biochem. test ů ENTEROtest, STAPHYtest, ANAEROtest, STREPTOtest, NEFERMtest……. Hodnocení: identifika č ní tabulky TNW program – identifika č ní skóre (%); T index 0-1

3 3 Dostanete neznámý vzorek…… M ůž e být izolátem z prost ř edí nebo naopak sou č ást mikroflory teplokrevných ž ivo č ich ů Cílovou skupinou našeho cvi č ení jsou fermentující enterobakterie s fakultativn ě anaerobním metabolismem (obyvatelé st ř eva) Odliší se od nefermentujících G- ty č ek z prost ř edí n ě kolika jednoduchými testy: KAT +, OX -, OF-test: fermentace glukózy +

4 4 Enterobacteriaceae 65 druh ů - gramnegativních ty č inek Pro č fakultativn ě anaerobní druhy – co je akceptor e - ? Trávicí trakt P ř ítomnost ve vod ě : ukazuje na fekální zne č ist ě ní V ě tšinou nepatogenní Patogenní jsou n ě které druhy: St ř evní infekce: Salmonella, Shigella a Yersinia Celkové infekce: Yersinia pestis (p ů vodce moru) a tzv. antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C) a n ě které kmeny E. coli (EPEC, ETEC…)

5 5 My jsme je ji ž pozorovali… E. Coli: kovov ě lesklé Salmonella, Shigella: - r ůž ové Ostatní koliformní: č ervené Koliformní druhy na Endov ě agaru, p ř i rozboru vody: mFC medium 44°C – č ervené kolonie (št ě pící laktózu –modré – fekální koliformní, E. coli)

6 6 Pokud vzorek odebíráme z t ě chto selektivních medií, m ůž eme provést rovnou ENTEROtest Postupy ve cvi č ení: Pokud máme vzorek na neselektivním mediu, tedy náš p ř ípad, provedeme 2 sklí č kové pokusy: 1) musíme nejprve ur č it G- typ bun ěč né st ě ny (enterobakterie jsou G-) 2) Enterobakterie jsou nadány schopností likvidovat peroxid vodíku – kataláza pozitivní bu ň ky této č eledi pod jeho tíhou šumí

7 7 Následovat budou demonstra č ní zkumavkové testy, u nich ž ode č teme výsledky a ur č íme, které neznámé vzorky fermentují. K tomu poslou ž í 1) OF test (oxidace-fermentace glukózy) 2) TSI test (triple sugar, iron) U fermentujících bun ě k provedeme ENTEROtest se standardním zákalem bun ě k a test na oxidázu – enterob.negativní (OXI test) a test produkce β -galaktosidázy št ě pící laktózu (ONPG test)

8 8 G- vs. G+ M ůž eme provést Gramovo barvení, tím mimo jiné zjistíme i morfologii bu ň ky č i morfologii shluk ů bun ě k, co ž jsou další d ů l.identifika č ní znaky, které urychlí rozhodování pro další testy G-/G+ však ur č í i rychlejší KOH test peptidoglykan

9 9 1)KOH test Na o ž íhnuté sklí č ko kápneme 3% KOH, v míst ě kapky lehce rozmícháme vy ž íhanou kli č ku s odebraným neznámým vzorkem G- bu ň ky mají slabou bun ěč nou st ě nu, která rychle uvolní obsah bu ň ky a za kli č kou se táhne viskózní suspenze: Na sklí č ku vpravo KOH test G- bu ň ky se táhnou za kli č kou Nelze pou ž ít u bakterií tvo ř ících sliz

10 10 2)Katalázový test Rozklad peroxidu vodíku na vodu a kyslík je katalyzován enzymem katalasou. P ř idáme 3% peroxid vodíku k bakteriální kultu ř e p ř ímo na mediu nebo na nát ě r bun ě k na sklí č ku. Pozitivní test se projeví uvol ň ováním bublinek kyslíku. Katalázový test na sklí č ku vlevo

11 11 Uvnit ř velké skupiny G- bakterií m ůž eme bakterie dále d ě lit na bakterie fermentující (fakultativn ě anaerobní metabolismus, který glukózu oxiduje i fermentuje, jako nap ř. naše cílová skupina enterobakterií) a bakterie s výhodn ě jším respira č ním metabolismem - nefermentující aerobní vibria, aeromonády, pseudomonády… Takové testy pro vzájemné odlišení enterobakterií od Vibrií, aeromonád spo č ívají v jednoduchých reakcích: test oxidázový, fermenta č ní (OF test)...

12 12 Vibria a aeromonády také št ě pí glukózu, ale jsou v ž dy oxidáza pozitivní – glukózu tedy nefermentují, jsou nefermentující Další skupiny gramnegativních nefermentujících baktérií (mohou to být ty č inky, ale i kokoty č inky č i koky) nikdy nešt ě pí glukózu. Oxidázu mohou mít pozitivní i negativní AeromonasVibrio cholerae

13 13 Ve cvi č ení dále následují dva demonstra č ní pokus, u kterých ode č teme fermentaci glukózy a u druhého vyu ž ití dalších cukr ů Tedy: 1) OF test a 2) TSI test

14 14 3) OF test test na oxidaci (aerobní metabol.)/ /fermentaci (anaerobní met.) = detekce respira č ních enzym ů pou ž ívá se medium s glukózou a acidobazickým indikátorem bromthiolovou mod ř í, která je následn ě ve vzniklém kyselém prost ř edí ž lutá, v zásaditém modrá alkalizací a p ř i neutrální reakci zelená - k OF testu se vyu ž ijí v ž dy dv ě zkumavky s vysokou vrstvou polotuhého media - inokulum č isté kultury se o č kuje vpichem - první se kultivuje aerobn ě bez parafinu (test oxidace), druhá anaerobn ě s parafinem (d ů kaz fermentace) - ode č et po 24h Enterobakterie krom pozitivní oxidace (respirace) glukózu i fermentují!!!

15 15 OF test - ode č et Pozitivní reakce oxidace č i fermentace GLUKÓZY se projeví ž lutým zbarvením PARAFIN tvo ř í anaerobní prost ř edí pro d ů kaz fermentace glukózy Ob ě zkumavky modré ob ě jsou negativní reakce neznámý vzorek glukózu ani neoxiduje, ani nefermentuje Zkumavka s parafinem vykazuje modrou negativní reakci fermentace. Neznámý vzorek však oxiduje glukózu = ž lutá Ob ě zkumavky ž luté ob ě jsou pozitivní reakce neznámý vzorek glukózu oxiduje i fermentuje = enterobakterie

16 16 Pokud ji ž tedy víme, ž e pracujeme s G- bu ň kou, která je navíc kataláza pozitivní a pod parafínem v OF testu m ě la pozitivní ž lutou reakci, bude to tedy fermentující enterobakterie. V OF testu mo ž no ode č íst i pohyb bun ě k – pohyblivé druhy tvo ř í „oblak“ kolem vpichu Zkusíme dále vyu ž ití t ř í cukr ů – ten dále rozd ě lí enterobakterie do menších skupin a otestujeme produkci sirovodíku a plynu v tzv TSI testu.

17 17 4) TSI test (tripple-sugar iron) Test na utilizaci t ř í cukr ů – glukózy, laktózy a sacharózy + testování produkce H 2 S a plynu acidobazický indikátor je bromkrezolová č erve ň - indikátor produkce H2S je ž elezo Laktóza 4-0 -(beta-D-galactopyranosyl)-beta-D-glukopyranóza Sacharóza α -D-glukopyranosyl- β -D-fruktofuranosid - medium ve zkumavce je o č kováno vpichem a vzáp ě tí hádkem po šikmém agaru v jediné zkumavce - sledujeme zabarvení po kultivaci 24-48h/37°C

18 18 Hodnocení TSI Sledujeme št ě pení glukózy, laktózy; plyn N ě které bakterie uvol ň ují sirovodík z aminokyselin obsahujících síru (cystin, cystein, methionin). Produkce je detekována pomocí síranu ž eleznatého (vytvá ř í se č erný sulfid ž eleznatý).

19 19 Pozitivní utilizace cukr ů : ž lutá barva a to: GLUKÓZA sledováva dole ve sloupci LAKTÓZA v šikmé horní č ásti agaru Fermentace laktózy i sacharózy – celé medium ž luté (E. coli !) V celé č ásti agaru sledujeme fermentaci laktózy nebo sacharózy nebo obou = celé medium ž luté. V této zkumavce lze sledovat i produkci plynu. V této č ásti agaru sledujeme fermentaci glukózy, ne sacharózy a laktózy. Negativní fermentace V této č ásti agaru sledujeme tvorbu sirovodíku, bublinky plynu a fermentaci glukózy plyn

20 20 Další p ř íklady r ů stu na TSI: Enterobacter cloacae – fermentace glukózy, produkce plynu, ne sirovodíku Staphylococcus aureus - kyselá reakce; = fermentace cukr ů Salmonella typhimurium fermentace glukózy a produkce plynu a H2S Micrococcus luteus vyu ž ívá pouze pepton media, ne cukry, jen na povrchu agaru Bacillus megaterium fermentace cukr ů, ale neroste v anaerobních podmínkách Enterobacter aerogenes fermentace glukózy, katabolismus peptonu

21 21 Pro zkvašování cukr ů platí následující pravidla: pokud kultura nekvasí glukosu, nekvasí ani jiný cukr. Kultura fermentující glukosu fermentuje i fruktosu a manosu. Fermentuje-li laktosu, nefermentuje maltosu a naopak.

22 22 5) Enterotest 16 pro další identifikaci fermentujících jamkové testy - do zkumavky s 2,5 ml fyziologického roztoku vyžíhanou kličkou nabereme neznámý vzorek bakterií a zamícháme, vytvoříme suspenzi buněk o standardním zákalu 1 dle Mac Farlanda

23 23 - automatickou pipetou o č kujeme 100 mikrolitr ů (sterilními špi č kami) homogenní supsenze bun ě k (!!) do ka ž dé jamky - jamky H1 a ž D1 zakápneme 2 kapkami parafinu (anaerobní reakce- testy pro sirovodík (H), lysin (G), indol (F), ornitin (E) a ureázu (D)) - po ř adí test ů na 1 desti č ce ENTEROtestu není samo o sob ě nijak zna č ené!!! - proto ž e ka ž dá skupinka pracuje s vlastním testem z originálního balení, musí si p ř ed jeho vyta ž ením z balení ozna č it ve dvojici h ř ebínk ů na stran ě A ř adu 1, tím po jeho vlo ž ení do nového stojánku poznáme „A“ č elo reakcí testu. - desti č ku ENTEROtestu umístíme podle „A“ č ela reakcí do svého stojánku -naproti druhé č elo testu ji ž m ůž eme ozna č it znamením své skupiny „A“ č elo reakce ozna č ený sloupec 1

24 24 Nesmí dojít ke kontaminaci sousedních jamek Testy se p ř i kultivaci ulo ž í do sá č ku aby nevysychaly ENTEROtest kultivujeme p ř i 37°C/16-4°h Do zbytku suspenze ve zkumavce steriln ě pinzetou namo č íme (o ž íhnutí hrdla zkumavky) test na oxidázu, papírek vytáhneme Poté do zkumavky vlo ž íme papírek ONPG testu a po o ž íhnutí hrdla dáme kultivovat spolu s ENTEROtestem Papírkové testy: 6) OXI test, 7) ONPG test

25 25 OXI test – enterobakterie jej mají negativní Pozitivní OXI test má tmav ě modrou barvu a to do 30 sekund. Do dvou minut zmodrá opo ž d ě n ě pozitivní reakce. Šedá č i nazelenalá barva po dvou minutách znamená reakci negativní. Test identifikuje tvorbu enzymu cytochrom c oxidasy (poslední enzym dýchacího ř et ě zce) ú č astnícího se p ř enosu elektron ů v elektronovém transportním ř et ě zci aerobních bakterií na kyslík (oxidace cytochromu c kyslíkem, kyslík je redukován). Oxidasové č inidlo obsahuje chromogenní oxida č n ě -reduk č ní č inidlo, které oxidací m ě ní barvu (tmav ě č ervenofialové).

26 26 Pozitivní ONPG reakce je po 4hodinách kultivace ž luté zbarvení. Jedná se o test na produkci enzymu betagalaktosidázy, který št ě pí laktózu (poznáme ji ž v TSI) Pozitivní ž lutá reakce po 24h kultivaci negativní V testu je pou ž íván bezbarvý o-nitrofenyl-ß- D-galaktopyranozid, který je v + p ř ípad ě hydrolyzován na ž lutý ortho-nitrofenol.

27 27 Hodnocení Získané údaje jsou zpracovávány podle klí čů a tabulek, č asto za pomoci po č íta č e. Proto ž e identifikace je zna č n ě náro č ná, poda ř í se jen málo typických vzork ů za ř adit a ž do druhu p ř ímo v provozních laborato ř ích. Proto ž e se vyskytují mutanty a jejich procento stoupá v souvislosti se vzr ů stajícím zne č išt ě ním ž ivotního prost ř edí, p ř echází se od identifika č ních klí čů, které uvád ě ly pouze pozitivní č i negativní reakce, k tabulkám, v nich ž je uvedeno procento kmen ů daného druhu, u nich ž je test pozitivní, eventueln ě zda výsledek kolísá i u bun ě k ur č itého kmene.

28 28 Hodnocení na desti č ce: Po kultivaci testu ode č ítáme pozitivitu č i negativitu reakcí podle tabulky interpretace reakcí. Test na indol a fenylalanin se krátce p ř ed ode č tem zakapává ka ž dý svým č inidlem. Vyplníme + a - výsledky

29 29 Ode č ítáme ENTEROtest pomocí pr ů hledného ví č ka, kde je zkratkami zazna č eno po ř adí reakcí

30 30 Identifikaci provedeme dle tabulky v návodu testu Nebo pomocí programu TNW, který nám po vypln ě ní +/- k reakcím identifikuje náš kmen, uká ž e v % identifika č ní skóre a T index. Pro typický kmen je T index roven 1. Pro atypický kmen nám test doporu č í p ř ípadné další rozlišující testy č i uká ž e naše nestandardní výsledky

31 31 Jako kontrola kvality pou ž itých chemikálií a kontrola interpretace barevných reakcí se pou ž ívají tzv.kontrolní kmeny bakterií, které dávají standardní výsledky. Tyto kontrolní kmeny dodává CCM v lyofilizovaném stavu nebo na ž elatinových discích. Mo ž né p ř í č iny neidentifikovatelného výsledku: - kontaminovaná kultura - malý objem inokula - kontaminace jamky - špatné p ř evrstvení parafinem - atypický kmen

32 32 Shrnutí Enterobakterie jsou gramnegativní ty č inky, 1-6 μ m dlouhé a 0,3-1 μ m široké, netvo ř í spory; pohyblivé druhy mají peritrichální bi č íky (Proteus..) Enterobakterie jsou nenáro č né chemoautotrofní bakterie, mezofilní – rostou v rozmezí °C, optimum je 37°C Po provedení oxidázového testu jsou enterobakterie oxidáza negativní (s.výjimkou rodu Plesiomonas, který k nim byl nedávno p ř i ř azen), tvo ř í katalázu (kataláza pozitivní) a v ž dy št ě pí glukózu (i tvorba plynu), dále redukují nitráty (p ř i fakultativní anaerobióze jsou toti ž nitráty akceptorem elektron ů )


Stáhnout ppt "1 Úvod do identifikace bakterií Základní biochemické testy Pr ů vodce po cvi č ení Salmonella typhi Proteus Yersinia pestis."

Podobné prezentace


Reklamy Google