Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Jozef Madžo Júlia Starková.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Jozef Madžo Júlia Starková."— Transkript prezentace:

1 Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Jozef Madžo Júlia Starková

2 Thalasemie  molekulární patogeneze Srpkovitá anemie / sickle cell anaemia léčba ovlivněním exprese genů Hemofilie genová terapie Geneticky podmíněné hematologické onemocnění

3 Hemoglobinopatie Poruchy v syntéze hemoglobinu

4 Hemoglobin    2 2 11  1 1 22 11 Chrom 16   GG A    Chrom 11   2  2 2  2 2  2 2  2  2  2 2  2 2  2 2  2  2  2 2  2 2  2 2  2  2  2 2  2 2  2 2  2  2  2 2  2 2  2 2  2  2  2 2  2 2  2 2  2 EmbryoFétusDospělý struktura genů hemoglobinové rodiny

5 Thalasemie Podle řetězce:  thalasemie  thalasemie   /  /  /    ... Z funkčního hlediska 0 úplná ztráta + částečná ztráta chyba v produkci globinového řetězce

6  Thalasemie  Poruchy v syntéze  -globinového řetězce snížená syntéza  řetězce chyba v syntéze  řetězce  +  + thalasemie  0  0 thalasemie defekt v transkripci  řetězce defekt v transkripci  řetězce abnormální processing mRNA abnormální processing mRNA abnormální translace mRNA abnormální translace mRNA nestabilní  - řetězec nestabilní  - řetězec

7  -thalasemie - defekt v transkripci  řetězce mutace v promotorové oblasti oblast –30nt (TATA box) res. -90 a – – 25% normálního množství  -globinu zejména časté u africké populace * delece  globinového řetězce obecně málo časté fenotyp  + fenotyp  0 1 výjimka 3`del: “Sind“ populace v Indii a Pákistánu 30% alel

8  -thalasemie - abnormální processing mRNA GTAGGTAG * mutace na přechodu exon – intron: `5-GT ––– AG 3` porucha sestřihu mRNA fenotyp  0 thalasemie

9  -thalasemie-abnormální processing mRNA 10% 90% GTAGGTAG TTGGTCT A mutace v „splice site consensus sequence“ konsensní oblast okolo invariantních nukleotidů GT– AG odkrytí kryptických sestřihových míst fenotyp  + thalasemie

10  -thalasemie - abnormálna translace mRNA mutace non-sense předčasné zavedení stop kodonu:kodon-17 Jižní Asie kodon-39 Středomoří fenotyp  0 thalasemie mutace v iniciačním kodonu redukují efektivitu translace fenotyp  + thalasemie mutace „frameshift“ posun čtecího rámce: +1 res. –1 NT * * * AMK řetězec ribozom cap AAAAAAAA STOP AUG

11  -thalasemie - abnormální stabilita  globinu Pozměněná stabilita  globinu mutace na úrovni DNA substituce in-frame delece in-frame inzerce fenotyp  + až  0 thalasemie normální  globin modifikovaný  globin

12 genová frekvence – 0,14 západní ekvatoriální Afrika – 0,1 Saudská Arábie a část Indie – 0,04 Jižní a Severní Amerika (USA8% heterozygotů, 1 z 500 obyvatelů trpí onemocněním) Výskyt SCD (Sickle Cell Disease)

13 kodominantní vztah alel  shodná frekvence u žen a mužů preference heterozygotů  odolnost vůči malárii; Plasmodium falciparum - normální alela - mutantní alela SCDzdravýheterozygot Dědičnost SCD heterozygot

14 Vyšetření mutace I.

15 Vyšetření mutace II.

16 HbS deoxy polymerHbS oxy  6 globin: Glu  Val O2O2 O2O2

17 vytvoření polymerů HbS u deoxygenních erytrocytů  formování srpkovitých buněk zvýšená adheze erytrocytů k endotelu abnormální kationtová homeostáza  buněčná dehydrace vasokonstrikce (via NO, endothelin-1)  prodloužení mikrovaskulárního tranzitu erytrocytů Patofyziologie SCD

18 Klinické projevy nedostatečné proudění krve v krevních cévách nedostatečné zásobování kyslíku v kostech, svalech, plících, mozku, srdci splenomegalie - infekční choroby bolesti končetín, acute chest syndrome, mozkové příhody

19 tranfúzní program transplantace kostní dřeně (~ 5% mortalita) blokátory iontových kanálů anti-adhezivní a protizánětlivá léčba (anti-P-selectin, inhibitor NFκB) inhalace NO genová terapie lentivirový konstrukt s β A-T87Q globinovým genem transdukován do HSC a transplantován dvěma myším  inhibice dehydratace a deformace erytrocytů, ústup splenomegalie a hypostenurie Terapie I.

20 Terapie II. Hydroxyurea –cytotoxická látka; zvyšuje koncentraci HbF –zvýšení množství HbF a F buněk –inhibice kationtové deplece, adhezivity s endotelem –nevýhody – velký počet non-respondentů, karcinogenní a leukemogenní efekt při dlouhodobé léčbě –teratogenní účinek byl pozorován u zvířat

21 X Metylace transkripčne aktívní chromatín transkripčne neaktívní chromatín DNMT cytozín 5-metyl cytozín

22 promotorová oblast γ-globínu u dospelého po podání hypometylačních látek CGACGCGTTCGCCCGCG promotorová oblast γ-globínu u dospělého CGACGCGTTCGCCCGCG X promotorová oblast γ-globínu po narození CGACGCGTTCGCCCGCG DNMT hypometylační látky DNA

23 Terapie III. Hypometylační látky 5-azacytidine inkorporace do DNA a RNA, kovalentní vazba s DNA metyltransferasou (DNMT; udržuje metylační pattern během replikace) účinek: u paviánů násobné zvýšení exprese γ-globinového genu; metylace γ-globinového promotoru snižuje koncentraci HbF (10-25%), F buňky (30-40%) 5-aza-2’-deoxycytidine(decitabine) inkorporace do DNA, účinnější než 5-azacytidin hypometylace γ-globinu; zvýšení acetylovaného H3 a H4 asociovaného s γ-globinovým promotorem

24 První studie na pacientech 8 pacientů léčených intravenózně decitabinem 2 týdny (5 pacientů nezvyšovalo hladiny HbF, 2 pacienti neodpovídali na léčbu HU a 1 nebyl léčený HU) 3,5%  13,5%HbF 21%  55% F buňky sledování toxicity 63 týdnů – bez toxických příznaků, výskyt neutropenie 8 pacientů léčených subkutánně decitabinem 6 týdnů (pacienti neodpovídali na léčbu HU) 6,5%  20,4% HbF 38%  71% F buňky

25 Koagulopatie Poruchy v syntéze proteinů koagulační kaskády

26 Hemofilie: genetický podklad Hemofilie (dědičná porucha v produkci koagulačního faktoru) PodtypyA: F – VIII. B: F- IX. Hemofilie A chromozóm X vázána porucha  Xq28 => častější výskyt u mužského pohlaví X h Y => ženy přenašečky X h X F VIII produkován hlavně v játrech deficient F VIII -  hemofilie A za přítomnosti všech ostatních faktorů

27 Hemofilie A

28

29 pokrok v ½ 20.stol. - Krevní infúze a produkty plazmy 80-tá léta HIV infekce => alternativní zdroje FVIII substituční terapie:moAB purifikovaný FVIII rekombinantní FVIII Hemofilie: léčba 1 Vznik inhibitoru anti-FVIII Ab resp. anti-FIX Ab 3 – 20% pacientů s těžkou Hemofilií B a A

30 Hemofilie: léčba 2 rFVIIa NovoSeven® (Novo Nordisk) rhFVIIa u pacientů s inhibitorem: anti-FVIII Ab anti-FIX Ab při příhodách  krátký poločas (2,7h) FVIIa/TF FIIaFII FXa/FVaFX FIXa/FVIIIa FIX FXI TFPI

31 Genová Terapie 1 ADA deficient SCID X-linked SCID Gaucher´s disease chronic granulomatous disease Fanconi´s anaemia HIV haemoglobinopathies haemophilia

32 Proč je hemofilie vhodná pro genovou terapii? Zvýšení hladiny faktoru >1% odstraní nejtěžší příznaky a vede ke snížení mortalityZvýšení hladiny faktoru >1% odstraní nejtěžší příznaky a vede ke snížení mortality faktor může být produkován širokým spektrem buněkfaktor může být produkován širokým spektrem buněk široké „terapeutické okno“: 1.5% až 100% normálních hladin faktoruširoké „terapeutické okno“: 1.5% až 100% normálních hladin faktoru zvířecí modely (psi a myši) a myší a psí geny pro faktory VIII a IX k disposicizvířecí modely (psi a myši) a myší a psí geny pro faktory VIII a IX k disposici jednoduché sledování výsledků léčby - laboratorní i klinickéjednoduché sledování výsledků léčby - laboratorní i klinické

33 nejběžnější Genová Terapie 2 Typy dle provedení: normální gen je vložen na nespecifické místo v genomu.. výměna abnormálního genu homologní rekombinací.. oprava pomocí selektivní reverzní mutace, která vrací gen do normální funkce. Genová terapie - opravy defektního genu odpovědného za vývoj nemoci

34 Genová Terapie 3 In vivo: přímé podání Ex vivo: není pracné vhodné pro „highthroughput“ = komerční využití pracné pro provedení individuální přístup vyšší účinnost DNA fibroblasty selekce+expanze

35 Hemofilie: genová terapie - vektory Nevirové: „nahá“ DNA retroviry adenoviry Virové: AAV (adeno-asociované viry)

36 Genová terapie hemofilie do roku 2004 sponzorfázenvektorhladinavedlejší efekt ChironI.13retrovirus / iv0-1%bez THTI.6 Plazmid / omentum non-viral, fibroblasty do omenta 0-4%bez AvigenI.9AAV2 / i.m0-1%bez AvigenI.6AAV2 / intrahepatic3-12%  transamidasa GenstarI.3 Adenovirus / iv specifická exprese v játrech 0-1%  transamidasa trombocytopenia „Chinese Trial“ I.2 transdukované fibroblasty do 6% do konce roku 2003 v USA proběhlo 5 studií sponzorované biotechnologickými firmami, které vyvinuly vektor

37 studie1: Chiron studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 13 s těžkou hemofilií A (HIV a HCV pozitivní) vektor:retrovirální (deletováná B doména hFVIII) podání:intravenózní infuze dávka:3x x10 8 vp/kg efekt:u žádného hladina FVIII ne z  : <1% komentář:limitována kapacita retrovirálné integrace do nedělicích se buněk jater a nepřítomnost pro játra specifického promotoru ve vektoru

38 studie2: THT studie: fáze I. pacientů: 6 s hemofilií A vektor:plazmid elektroporovaný do autologních fibroblastů podání:injekce do omenta dávka:100M – 400M buněk efekt:u 4 / 6 hladina FVIII z  oproti původní až na 4% komentář:redukce užívaní rekomb./purif. faktoru a spontánního krvácení u všech pacientů po dobu 12 měsíců pokles:? gene silencing, imunologický dozor „clerance“, zestárnutí „senescence“ reimplantovaných fibroblastů

39 studie3: Avigen I. studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 9 s hemofilií B vektor:AAV2 s hFIX cDNA podání:intramuskulární injekce dávka:nejnižší - 2x10 11 vp/kg efekt:hladina z  na 1-2% (neměnila se při  dávkách injekcí) komentář:50% redukce užívaní faktoru a spontánního krvácení po dobu 40 měsíců virus detekován ve všech tělesních tekutinách kromně spermatu neutralizační anti-AAV2 protilátky v závislosti na dávce viru

40 studie4: Avigen II. studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 6 s „těžkou“ hemofilií B (HCV pozitivní) vektor:AAV2 s hFIX cDNA podání:injekce do hepatální arterie dávka:8x10 10 – 2x10 12 vp/kg efekt:hladina z  do 2% (4pacienti - nízká a středních dávka) hladina z  3-12% (2pacienti - nízká a středních dávka) komentář:trvání 2-3 týdny dále po 6 týdnech pokles <1% dočasně pozastaveno virus detekován ve spermatu, nepotvrzen ve spermiích pokles FIX koreloval se vzestupem (9x) jaterní transaminasy

41 studie5: Genstar studie: fáze I. „dose escalation study“ pacientů: 3 s „těžkou“ hemofilií A vektor:oslabený („gutless“) adenovisus s hFVIII cDNA podání:intravenózní injekce dávka:nízké - vysoké efekt:bez signifikantního z  hladiny (bez ohledu na dávku) komentář:u vysoké dávky vzestupem jaternítransaminasy a trombocytopenie

42 Genová terapie hemofilie do roku 2003 sponzorfázenvectorhladinavedlejší efekt Chironfáze I13retrovirus / iv0-1%bez THTfáze I6 Plazmid / omentum non-viral, fibroblasty do omenta 0-4%bez Avigenfáze I9AAV2 / im0-1%bez Avigenfáze I6AAV2 / intrahepatic3-12%  transamidasa Genstarfáze I3 Adenovirus / iv specifická exprese v játrech 0-1%  transamidasa trombocytopenia „Chinese Trial“ fáze I2 transdukované fibroblasty do 6% 420 dní ? fáze I % dočasně CELKEM: 37 (39) pacientů x imunitní odpověď +/- NÍZKÁ ÚČINNOST...

43 vektory (i oslabené) vyvolávají zánětlivou reakci 1 úmrtí po podání Adenovirálního vektoru do hepatální artérie (zánětlivá reakce, horečka, respirační potíže  multiorgánové selhání Studie s „gutted“ Adenovir. V. zastavena po objevení: horeček, trombocytopenie (obnovena s nižšími dávkami) riziko vzniku malignity Náhodné chromozomální integrace: aktivace protoonkogenů / inaktivace tumor supresorů 2/10 případy leukémie „Phase I“klinické studie SCID retrovirální vektor integrován v blízkosti protoonkogenu LMO2 leden 2003 FDA pozastavilo všechny studie s retrovir. v. u krevních kmenových buněk Hemofilie: genová terapie Ano? – Ne? phase I/II klinické studie nebyla přerušena u žádného pacienta bez vzniku inhibitoru zvýšení hladin FVIII/FIX (nižší než u zvířecích modelů) - klinicky nesignifikantní Ekonomické kriterium Finančně dostupné pro rozvojové země Jen 20% pacientu má přístup k „high-tech“ terapii z ekonomicky rozvinutých zemí Možnost opravy porušených genů náhrada mutovaného úseku DNA za nemutovanú DNA nové nevirové vektory: DNA-RNA oligont. Zvířecí modely Zavedené modely „Primum non nocere“

44 Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Publikace prezentace > Výukové presentace

45 Trombofilní stavy

46 Faktor Va Faktor V Faktor Vi Proteolysa Proteolysa APC S thrombinprothrombin (gen) CGA CAA 1691 (protein) R Q 506 familiární trombophilie APC resistence

47 homozygot wildtype wildtype heterozygot homozygotmutant Detekce Leidenské mutace FV a genu pro prothrombin Výsledek do 2 hodin od náběru...


Stáhnout ppt "Molekulární hematologie nemaligní onemocnění Jozef Madžo Júlia Starková."

Podobné prezentace


Reklamy Google