MITOCHONDRIE a nemoc.

Prezentace na téma: "MITOCHONDRIE a nemoc."— Transkript prezentace:

1 MITOCHONDRIE a nemoc

2 Mitochondrie v buňce Funkce MTCH v buňce „in vivo“
= největší zájem výzkumu v bioenergetice - buňka je složitější systém než izolovaná MTCH - obtížnější přístupnost (cytoplasma, membrány) Faktory ovlivňující bioenergetické chování MTCH 1) přísun substrátu z cytoplasmy 2) buněčný obrat ATP - cytoplasma, membrány 3) iontové prostředí v cytoplazmě (zejména konc. Ca2+) 4) redoxní stav buňky

3 Faktory ovlivňující MTCH
Změna energetických nároků buňky = změna hodnoty faktorů ovlivňujících MTCH Přenos řadou signálů: a) propustnost iontových kanálů b) hormonální signály c) tvorba ROS a RNS Fúze a dělení mitochondrií = jedna z odpovědí MTCH na podněty

4 Faktory ovlivňujících funkci MTCH

5 Problémy při studiu buněčné bioenergetiky
a) přístup zkoumaných látek k MTCH b) jiné dráhy ovlivnění MTCH (metabolická aktivace) c) vliv látek na jiné buněčné systémy d) kompartmentace - interpretace ATP/ADP, GSH/GSSG Příklad 1 - plasmatická membrána a zdroj energie - propustná pro glukosu, pyruvát, laktát x nepropustná pro succinát Příklad 2 - protonofory působí i na jiné membrány s H+-ATPasami (lysosomy, synaptické vesikuly) způsobují vyčerpání cytoplasmatického ATP = dvojitý účinek - zamezení oxidativní fosforylace - reverze ATPasy a spotřeba ATP produkovaného glykolýzou (lze inhibovat oligomycinem)

6 Mitochondriální transport Ca 2+
dovnitř: Ca2+ uniport - vysoce aktivní (105 konc. gradient při 150mV) efflux: Ca2+ /3 Na+ antiport (nízká aktivita - řádově několik %)

7 Akumulace Ca2+ v izolovaných MTCH
- masivní akumulace při vnější konc. větší než 0.5 M - v matrix až řádově 1M - díky současnému importu Pi * neutralizace nárůstu pH * komplexace Ca2+ do osmoticky neaktivního gelu - nedochází k bobtnání Vysoká aktivita Ca 2+ uniportu = za určitých podmínek všechna respirační aktivita použita pro Ca2+ akumulaci - probíhá do rovnováhy mezi přenosem do a z matrix - kinetická rovnováha ("set-point") - funkce MTCH jako "pufrovacího systému" pro konc. Ca2+

8 Transport Ca2+ a regulace MTCH metabolismu
Ca 2+ v rozmezí m reguluje aktivitu enzymů: A) fosfatasa pyruvátdehydrogenasového komplexu - tvorba aktivní defosforylované formy s vyšším Vmax B) NAD+-isocitrátdehydrogenasa - snížení Km = zvýšení aktivita TCA cyklu při nižší konc. substrátu C) 2-oxoglutarátdehydrogenasa - snížení Km pro substrát Zvýšená potřeba ATP - převod hormonálního signálu na zvýšenou konc. cytoplasmatického Ca2+ - zvýšené cyklování Ca2+ do MTCH = zvýšení MTCH koncentrace Ca2+ - důležitý mechanismus v neexcitabilních buňkách

9 Přechod mitochondriální propustnosti
MPT, „mtch permeability transition“ - při překročení určité meze akumulace Ca2+ - zahrnuje kolaps p, bobtnání matrix a prasknutí vnější membrány - jeden ze součástí kaskády dějů vedoucích k apoptóze Fyziologický význam MPT: Ca-kanál s nízkou vodivostí ?? cyklosporin A (imunosuprese) * zabraňuje nástupu MPT * inhibitor Ca2+-dep. fosfatasy kalcineurinu * tvorba peptidového komplexu inhibující přenašeč adeninových nukleotidů ANT - oxidativní stres (indukovaný např. t-BuOOH) * usnadnění přechodu do MPT

10 Proteiny účastnící se tvorby MTCH pórů

11 MTCH a buněčná homeostáze Ca2+
Cytoplasmatický pool Ca omezen * obvykle M (pod limitem pro akumulaci v MTCH) * 3 mebrány mají transportní cesty pro Ca2+ a regulují Ca2+ CYT = cyt, mtch, ER 1) Plasmatická membrána - dynamické a rychlé udržování rovnováhy pro vstup a efflux Ca2+ - Ca2+/H+-ATPasa - 3 Na+/Ca2+ antiport Specifický případ - neurony - vysoký nárůst Ca2+ po aktivaci Ca2+ kanálů (potenciálem, ligandy) - vede k akumulaci Ca2+ v matrix 2) Endoplasmatické retikulum - lokalizováno v blízkosti MTCH - Ca 2+ uvolněné ER je přednostně akumulováno MTCH

12 Buněčná homeostáze Ca 2+

13 Tvorba ROS v MTCH Tvorba superoxidu v komplexu III
- Em,7 pro 2-stupňovou oxidaci UQH2 v Qp-místě komplexu III UQ.-/U ……… mV = silně redukující navíc je spojena s přechodem e- na opačnou stranu membrány = čím vyšší , tím zápornější Em,7 Molekulární O2 má přístup ke Qp = určitá pravděpodobnost přechodu e- místo na bL O2 + 1e- = O2.- …….. Em.7 = -160mV * zvýšená produkce superoxidu při vysokém  (přechod ze stavu 3 na 4) * může dosáhnout až 4% celkové spotřeby O2 Ověření: antimycin = inhibitor komplexu III - vazba na Qn-místo - zábrana přenosu e- přes membránu na cytochromy b - zvýšení obsazení Qp-míst UQ.- a tím i tvorby superoxidu

14 Tvorba superoxidu v MTCH
Komplex III - tvorba na vnější straně vnitřní MTCH membrány - záporný náboj neumožnuje vstup do matrix - výstup do mezimembránového prostoru a dále - detoxifikace: cytoplasmatická Cu,Zn-SOD Komplex I - méně jasný mechanismus - podíl na tvorbě O2.- podle typu MTCH - nezávislé na hodnotě  při přechodu stavu 4-3 - použití sukcinátu jako substrátu = tvorba O2.- reverzním přenosem e- - inhibice rotenonem = lokalizace tvorby na NADH-vazném místě - detoxifikace Mn-SOD v matrix (SOD2) - knock-out letální následky Komplex IV - postupná redukce O2 přenosem 4 elektronů - pevná vazba intermediátů = neuvolňuje se žádný superoxid

15 Oxidační stres v MTCH Nejvýznamnější redoxní páry matrix
GSSG/GSH mV NADP+/NADPH mV NAD+/NADH mV - nerovnováha mezi páry NADP a NAD udržována: * p-závislou transhydrogenasou * NADP-závislou isocitrátdehydrogenasou Příklad: MTCH mozkových neuronů - cca 5 nmol celkového glutathionu na 1mg proteinu - cca 88% v redukovaném stavu ve stavu 4

16 Oxidační stres v MTCH

17 Oxidační stres v MTCH Tvorba ROS
- histochemické pozorování v konfokálním mikroskopu

18 MTCH a buněčná smrt

19 MTCH a buněčná smrt Apoptóza rakovinné buňky
- vyvolaná cytotoxickým kancerostatikem Apoptóza buněk sítnice - slepota (retinis pigmentosa) - spojena s produkcí NO - projevuje se až s nástupem dospělosti

20 MTCH a buněčná smrt - nekróza = zakončena lýzou plasmatické membrány
- apoptóza = uspořádaný mechanismus strávení buněčného obsahu s minimálním "průsakem" ven MTCH a programovaná buněčná smrt: kaspázy = skupina proteas (C-strana Asp) - klíčová role při apoptóze * aktivace z neaktivní formy proteolýzou 2 cesty aktivace: 1) vazba ligandu na TNF-receptor - aktivace prokaspázy 8 2) "apoptosom" agregující prokaspázu-9 - součástí je cyt Buňky "typ 1" - dostačující cesta 1 pro vyvolání apoptózy = bez úlohy MTCH Buňky "typ 2" - úloha cyt c uvolněného z mtch

21 Nekróza a apoptóza

22 Dráhy aktivace apoptózy

23 Dráhy aktivace apoptózy

24 Mechanismus uvolnění cyt c z MTCH
- nejméně objasněný z celého mechanismu apoptózy - cyt c je volně pohyblivý v mezimembránovém prostoru MTCH Hypotézy mechanismu: 1) Aktivace faktoru Bax - tvorba specifického póru ve vnější membráně 2) Neselektivní prasknutí vnější membrány při bobtnání matrix Uvolnění cyt c je následek otevření MTP (mtch permeability transition pore) Experimentální model * t-BuOOH v hepatocytech - spotřeba GSH v reakci GPX

25 MTCH fission

26 Dráhy apoptózy vyvolané NO
NO overview

27 MTCH a nekrotická buněčná smrt
- ireverzibilní porušené tkáně po přerušené dodávce krve a) "reperfúzní poranění" - srdce (infarkt), b) okamžitá nekróza - mozek (mrtvice) + vzdálenější okolí centra také reperfúzní poranění ad a) „Reperfusion injury“ vznik podmínek usnadňujících MPT - akumulace Ca2+ v matrix, málo ATP, oxidativní stres - vznik RNS, tvorba peroxynitritu nitrosační a nitrosylační modifikace proteinů

28 MTCH a ischémie ad b) Ischémie
- narušení přesně regulované ATP-dep. kompartmentace glutamátu Glutatamát = hlavní neurotransmiter mozku živočichů * funkce závislá na precizní kompartmentaci a udržování nízké hladiny * při ischémii - nárůst konc. Glu v cerebrospinálním moku z 1M na 100 M - aktivace NMDA receptorů = disipace gradientu Na+ = nemožnost zpětného čerpání Glu do buněk = akumulace Ca2+ v neuronu Neurony = vysoká odolnost na MPT x po delším vystavení Glu narušení homeostázy Ca2+ a nástup nekrózy neuronů Hypotéza - akumulace Ca2+ vede k oxidativnímu stresu x neprokázáno na isolovaných mtch

29 Ischémie – vliv antioxidačních enzymů a lapačů radikálů

30 MTCH genom Kruhová dvojšroubovice 16kpb 37 genů - velice kompaktní
* 22 genů pro tRNA * 2 geny pro rRNA * 13 genů pro polypeptidy - součásti komplexu I, cyt b, komplex IV a Fo-podjenotky ATP synthasy

31 MTCH genom

32 Mutace mtDNA Heteroplasie * Jedna buňka - stovky MTCH
* Jedna MTCH - mnoho kopií mtDNA = mutace nejsou uniformní, výskyt na subpopulaci genomu v rámci buňky nebo organely - projev poruchy až po překročení určité limitní hodnoty mutací - stupeň bioenergetických poruch se liší podle orgánu a jednotlivce - replikační kinetika MTCH mateřská dědičnost MTCH odstranění MTCH spermatozoidů proteazomem vysoká tvorba energie = tvorba ROS = poškození DNA? Genetické poruchy - častý projev jako encefalomyopatie - souvislost v vysokými energetickými nároky mozku a svalů

33 MTCH a genetické poruchy

34 Mutace nDNA mitochondriálních genů
* Leighova nemoc (subakutní nekrotizující encefalopatie) flavoproteinová podjednotka SDH projevy: ztráta sání, motorických schopností (3m-2roky) * Fatální multisystémová deficience komplexu I: Fe-S Protein 4 NADH-Dehydrogenasa (ubiquinone) 18-kD (AQDQ) podjednotka komplexu I * Barthův syndrom (kardiomyopatie) „3-metylglutakonová acidúrie typu II“ výskyt 120 svět/1 ČR x odhad 1: taffazin (Xq28) – acyltranferasa (produkce kardiolipinu) ~ 1,000 mtch peptidů kromě respiračního řetězce SOD2 - porucha vede k kardiomyopatii a neonatální smrti

35 Mutace mtDNA a diabetes

36 MTCH a neurodegenerativní poruchy
Obecně pro neurony: - slabý pokles respirační aktivity může výrazně zvýšit pravděpodobnost buněčné smrti

37 Parkinsonova nemoc Riziko v populaci 1:40
Příznaky - bradykinesie, tuhost, třesot Morfologie - ztráta dopaminergních neuronů v substantia nigra Příčiny - neznámy (genetické, environmentální toxiny, ...?) Spojitost s MTCH - pethidin ("design drug") - indukce Parkinsona u uživatelů * nečistota MPTP - oxidace monoaminoxidasou A na MPP+ (1-methyl-4-fenylpyridinium) * selektivní transport - přes receptory dopaminu lipofilní kation = akumulace v matrix v závislosti na  slabý inhibitor komplexu I (Ki = 10-4) x in vivo toxický v nmol koncentraci Neurony mohou přežívat s častečnou inhibicí komplexu I x smrt při vystavení vysoké zátěži, vystavení toxinům Zvýšená citlivost dopaminergních neuronů ~ oxidativní stres spojený s metabolismem dopaminu

38 Huntingtonova nemoc * autosomální dominantní porucha
Příznaky - ataxie, demence, nekontrolované pohyby Morfologie - postižení GABA neuronů v caudate nucleus neostriata Gen pro huntigtin (nukleární 350 kDA protein s neznámou funkcí) - zvýšená expanze CAG - do 38 Gln bez pathologie x více než 40 Gln = agregace huntigtinu v jádře a CYT Spojitost s MTCH výrazná deficience komplexu II a III redukce akonitasové aktivity (TCA cyklus) souvislost s oxidativním stresem - Fe-S centrum citlivé na superoxid a ROS HD lze u primátů vyvolat 3-nitropropionátem = ireverzibilní inhibitor sukcinát-DH

39 Friedreichova ataxie (FRDA)
Výskyt v popuulaci 1: * autosomální recesivní mtch porucha * nejčastější dědičná ataxie v dětství Morfologie - degenerace dlouhých senzorických neuronů, kardiomyopatie, diabetes Gen pro frataxin (mtch protein neznámé funkce) * abnormální expanze GAA v intronu 1 * normální 34 repetic x patologicky až 1300 Spojitost s MTCH pravděpodobně souvisí s metabolismem železa porucha tvorby Fe-S center ?

40 Alzheimerova nemoc * nejčastější neurodegenerativní nemoc
= obrovský výzkum, peníze, ... * přesný mechanismus zatím neznám = vše hypotézy snížený mozkový metabolismus (pozitronová tomografie) - zvýšený výskyt mutací v komplexu IV = redukce cca 40% aktivity - souvislost s APP (amyloid precursor protein family) * tvorba agregátů beta-amyloidních peptidů velmi typická pro Alzheimera * v přítomnosti Fe3+ nebo Cu2+ - generace peroxidu, oxidativní stres ...

41 Faktory při rozvoji Alzheimerovy nemoci

42 amyotrophic lateral sclerosis
Protein nitration Nitrace proteinů u neurodegenerativních poruch amyotrophic lateral sclerosis

43 Nitrace proteinů při zánětu
Protein nitration Nitrace proteinů při zánětu

44 Nitrace proteinů – astmatická plíce
Protein nitration

45 Protein S-nitrosylation
Nitrosylace jako regulační signál Protein S-nitrosylation A. Buňka v klidu B. Aktivace Fas C. Aktiva apoptotické dráhy Nitrosylovaný cyt-c je uvolněn do cytoplazmy společně s aktivovanou kaspázou-3

46 Příště: