Nukleové kyseliny Organizace genomu

Prezentace na téma: "Nukleové kyseliny Organizace genomu"— Transkript prezentace:

1 Nukleové kyseliny Organizace genomu
David Kaftan, 2014

2 Nukleové kyseliny DNA, RNA, centrální dogma DNA RNA
struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962 báze, nukleosidy, nukleotidy primární- komplementarita bazí sekundární- dvoušroubovice terciární replikace reparace mutace RNA struktura jednošroubovicová mRNA a hnRNA tRNA rRNA snRNA transkripce a úpravy RNA translace-proteiny

3 DNA a RNA jsou polymery purinových a pyrimidinových nukleotidů
dlouhé, nerozvětvené polymery monomer – nukleotid purinová nebo pyrimidinová báze pentosový cukr fosfátová skupina DNA 2-deoxyribóza purin: adenine, guanine pyrimidin: cytosin, thymin RNA ribóza přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní pyrimidin: cytosine, uracyl

4 De-novo syntéza pyrimidinů
CO2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu kyselina orotová + fosforibosyl pyrofosfát (PRPP) uridine TP cytidin TP syntéza v plastidech UMP udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do DNA dTMP dUMP + methenylhydrofolate metylace, deaminace dCDP (Lemna major)

5 De-novo syntéza purinů
syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním uhlíků glycin CO2 formyl a methenyl tetrahydrofolát (THF) amidové skupiny kyselina asparagová glutamin syntéza v cytosolu

6 Katabolismus a recyklace nukleotidů
hydrolýza DNA, RNA oligonukleotidy mononukleotidy nukleosidy, báze syntéza jednostupňová reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy dvoustupňová nereverzibilní báze + PRPP  ribonukleotid + PPi báze + (deoxy)ribóza 1-P  (deoxy)nukleosid + Pi (deoxy)nukleosid + ATP (deoxy)nukleotid + ATP

7 Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů
kovalentní fosfodiesterová vazba fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů dva funkční konce 3‘ volná hydroxylová skupina 5‘ volná fosfátová skupina

8 Párování bazí v DNA převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice jedna otočka za 3.4 nm 10.1 párů bazí na otočku flexibilní vodíkové vazby mezi vlákny chybí vazby mezi „patry“ A – T dvě vodíkové vazby G – C tři vodíkové vazby párování hnáno zvýšením entropie vznik dvouvlákna snižuje entropii hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie

9 Alternativní struktury DNA
B forma nejčastější A DNA dehydratovaná forma RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice in vitro, ale i v buňkách Z DNA levotočivá šroubovice střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C

10 DNA v jádře je organizována v chromozómech
DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny histony malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA nehistonové proteiny chromatin nukleosom dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů H2A, H2B, H3, H4 solenoid stabilizován histonem H1

11 replikace DNA je semikonzervativní

12 Replikace jaderné DNA iniciace, elongace, terminace
S fáze buněčného cyklu iniciace zahájena na několika místech současně v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby) replikon celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku 50-70 kb rychlost replikace baktérie 1000 nukleotidů za sekundu eukaryota 100 nukleotidů za sekundu ukončení replikace při setkání vidliček počátek obsahuje charakteristickou sekvenci kvasinky – 200 bp savci – počátky i 10 kbp od sebe rostliny – není známo

13 Replikace DNA: replikační počátky

14 Replikace jaderné DNA oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T
vazba proteinů specifických pro replikaci DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání dvoušroubovice replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA DNA topoizomeráza rozplétá smyčky Primáza syntéza krátkých segmentů RNA komplementární s DNA DNA polymeráza připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

15 DNA polymeráza připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě Okazakiho fragmenty každý má svůj primer (asi 10 bazí) dodatečně pospojovány ligázou leading strand - kontinuálně rostoucí řetězec 1 primer lagging strand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec

16 DNA polymeráza připojování nukleotidů jen za primerem α , ε RNAza H
3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA α nesyntetizuje dlouhé fragmenty 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu postrádá exonukleázovou aktivitu , ε spojeno s PCNA dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů RNAza H odstraňuje RNA primer záměnou za DNA ligáza spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu

17 RPA, PCNA replikační protein A (RPA)
heterotrimerní struktura stabilizace jednovláknové DNA uvolněny Polα a Pol proliferating cell nuclear antigen (PCNA) homotrimerní struktura spojen s Pol a replikačním faktorem (Rfc)

18 DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci
připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování frekvence chyb 1:107 bp polymeráza ve směru 5‘-3‘ nukleáza ve směru 3‘-5‘ proofreading nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru

19 DNA mismatch repair snižuje chybovost 1:107 zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:109) rozeznání chyby vyštěpení chybné oblasti jedna baze celý úsek nemetylované DNA DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec ligáza napojí fragmenty

20 Změny ve struktuře DNA spontánní depurinace deaminace cytosinu
100 bazí za den a genom thymidinový dimer - UV záření alkylace guaninu stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů většina změn v nekódujících sekvencích

21 Oprava pyrimidinových dimerů
dimer indukováno UV světlem oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer excision repair

22 Post-replikační oprava
DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bp downstream) homologní rekombinace s komplementárním vláknem vyplnění chybějících částí DNA polymerázami napojení segmentů ligázami

23 Homologní rekombince opravy – uchování nezměněné DNA
meióza – zdroj variability nové kombinace DNA nové geny, RNA, proteiny odlišné gamety mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů poměrně časté reciproké vs. genová konverze

24 Homologní rekombinace: single-strand annealing
extrachromozomální plazmidová DNA T-DNA přerušení obou vláken obou duplexů exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí jednovláknový homologní úsek komplementární úseky jsou přiloženy (annealing) odstranění nehomologních částí oprava mezer nekonzervativní – jen jeden duplex přežije

25 Homologní rekombinace: double-strand break repair
meióza přerušení dvou vláken jednoho z duplexů přerušení rozšířeno endonukleázami 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexu kde slouží jako primery ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy

26 Homologní rekombinace: přenos vlákna
LIM15 (homolog RecA) synaptonemální komplex

27 Homologní rekombinace: one-sided invasion
krátké (žádné) homologní sekvence u rostlin častější než ostatní typy rekombinace traspozonní elementy vmezeření T-DNA přerušení obou vláken akceptorového duplexu přerušení rozšířeno exonukleázami jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního duplexu prodloužení invadujícího vlákna

28 Telomery koncové sekvence chromozómů konzervované repetitivní sekvence
telomeráza obsahuje RNA rozeznává terminální sekvenci bohatou na G opakovaně přidává repetitivní sekvence na konec telomery

29 Plastidy jsou endosymbionty
DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích

30 Plastidová DNA kruhový chromozóm rozdílné délky velký segment
malý segment invertovaný opakující se segment chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas tandemové opakování rRNA Euglena gracilis rozdílné délky Codium kb Acetabularia kb vyšší rostliny obvykle kb invertovaný segment: kb

31 Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny
enzym rostliny řasy fotosyntetizující Epifagus Euglena Porphyra počet 40 82 182 Genetický systém rRNA rrn 4 3 tRNA trn 30-32 17 27 35 ribozomální protein rps rpl 20-21 5-6 15 2 21 46 18 Fotosyntéza Rubisco a další rbcLpsa psb pet atp 29-30 26 NADH dehydrogenáza nhd 11 Biosyntéza 1-5 1 počet intronů 18-21 6 155 kolem 100 genů většinou všechny rRNA, tRNA klíčové geny pro enzymy fotosyntézy nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů 50-73 kb, cca 40 genů řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře

32 Mechanismus replikace plastidové DNA
mnoho kopií až 150 počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu frekvence replikace nezávislá na buněčném dělení u diferencujících se buněk synchronní u rychle dělících se buněk replikační počátky poblíž rRNA genů v invertovaných oblastech u tabáku pravděpodobně i další replikační počátky všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy, primázy

33 Mitochondriální DNA velká variabilita velikostí
Oenothera, Brassica: 200 kb Cucumis melo: 2600 kb rozsáhlé nekódující sekvence Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb neobsahují opakující se sekvence živočišné mitochondrie mají malý kompaktní genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí lineární Chlamydomonas cirkulární jeden kruhový chromozom Marchantia, Brassica mnoho subgenomických kruhových chromozómů

34 Homologní rekombinace subgenomických chromozómů
dynamika master cycle – subgenomic cycle rekombinace opakujících se sekvencích 2 isoformy 2 subgenomické cykly 3 kombinace subgenomických cyklů

35 Mitochondriální genom
malý počet genů oxidativní respirace syntéza ATP translace

36 Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií
promiskuitní DNA obsažena ve více kopiích jádro, mitochondrie, chloroplasty rostliny, živočichové, houby není jen jednosměrný transfer plastidy-jádro, jádro-plastidy plastidový ribozomální protein rpl23 nahrazen jaderným po inaktivaci původního plastidového chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23 přenos z chloroplastu do mitochondrií jednosměrný mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA

37 Transkripce DNA - geny gen protein DNA kód genom kódován DNA
kóduje protein protein DNA - aminokyselina sekvence aminokyselin -protein trojrozměrná struktura určuje funkci DNA kód 4-písmenná abeceda (A,G,C,T) kódující část genu menší část nekódující část kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat genom kompletní genetická informace DNA organismu

38 Organizace plastidového genomu
operon sekvence bakteriálních genů podobného typu transkribovaných najednou polycistronní transktipt klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné monocistronní transkript jeden transkript a jeden gen introny nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci exony kódující sekvence

39 Organizace jaderného genomu
asi jen 1 % DNA je transkribováno počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná gen promotor transkribovaná oblast exony introny 3‘ konec nesoucí regulační funkce

40 Organizace jaderného genomu
příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně umístění na chromozómu odděleně v klastrech, často opakujících se histony: x rRNA:

41 Transposable elements
mobilní DNA sekvence mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu transposony retrotransposony

42 Bakteriální transposable elements
vložené sekvence (insertion sequence elements) inverted repeat 5‘ GAGC-----GCTC 3‘ 3‘ CTCG-----CGAG 5‘ 1-2 kb mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu přesun více méně náhodný přesun jen DNA poměrně vzácně 1: buněk

43 RNA: primární struktura
lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů adenin, guanin, citosin, uracyl fosforylovaná ribóza párování s DNA A-U, T-A, G-C, ale také G-U méně stabilní než DNA volný 2‘ hydroxyl ribózy heteropolární řetězec 5‘ začátek 3‘ konec častá katalytická aktivita váha – S sedimentační koeficient Svedberg

44 Sekundární struktura RNA
většina tvořena jednotlivými vlákny lokální sekundární struktura smyčky, vlásenky výduť standardní párování G – C, A – U nestandardní párování G – U, U – U, G – A volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje vodíkovou vazbu k interakcím interakce domén vytváří terciální struktury

45 RNA je méně stabilní než DNA
2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu

46 Prekurzorová a mediátorová RNA
mRNA – messenger (mediátorová, informační) kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů (1-2% celkové buněčné RNA) nejméně stabilní hnRNA - heterogenní nukleová pre-mRNA - prekurzorová mRNA vzniklá v jádře, tzv. primární transkript delší než samotný strukturní gen různé oblasti DNA exony (kódujicí) introny (nekódujicí) působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA

47 Transferová RNA tRNA – transferová (přenosová) mitochondrie
přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na ribosom většina 4S RNA mitochondrie chybí většina celého setu import s cytoplazmy chloroplasty obvykle soběstačné paraziti importují z cytoplazmy cytoplazma

48 Ribosomální RNA rRNA – ribosomální součást ribozomu 3 typy ribozomů
malá podjednotka velká podjednotka 3 typy ribozomů cytoplasmatické plastidové mitochondriální

49 malé RNA malé RNA účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA RNA splicing: U1, U2 ,U4-9, U11, U12 úprava 3‘ histonové mRNA: U7 snoRNA – malé jadérkové RNA pre rRNA processing scRNA – malé cytoplasmatické RNA cRNA – chromosomová RNA miRNA – mikro RNA regulace a stabilita translace mRNA telomerázová RNA templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů 7SL RNA import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula

50 Genetická informace kódovaná v RNA
virus tabákové mozaiky jednovláknová RNA proteinový kabátek kódován RNA Gierer a Schramm 1956 samotná RNA způsobuje infekci Fraenkel-Conrat, Singer 1957 hybridní virové částice RNA a cizí protein nové virové částice obsaohvaly vlastní protein

51 Transkripce DNA na RNA syntéza od 5‘ směrem k 3‘
templátové vlákno DNA přepsáno do komplementárního vlákna RNA identické s komplementární DNA uracil místo thyminu RNA polymeráza se pohybuje po DNA ve směru od 3‘ k 5‘

52 RNA polymerázy RNA polymeráza se váže slabě k DNA
podobná struktura bakteriálních a eukaryotních polymeráz

53 jaderná RNA polymeráza
RNA polymeráza I jadérko 25S, 17S a 5.8S rRNA RNA polymeráza, II nukleoplasma mRNA, U1, U2, U4, U5 RNA polymeráza III nukleoplazma třída 1 5S rRNA třída 2 tRNA třída 3 U3, U6, další malé stabilní RNA

54 jaderná RNA polymeráza
struktura dvě velké podjednotky (125 a 220 kDa) několik dalších malých podjednotek 5 z nich společné všem polymerázám 220 kDa podjednotka RNA polymerázy II C terminální doména YSPTSPS transkripční faktor II H (TFIIH) kináza fosforylující Ser, Thr uvolnění RNA polymerázy II s promotoru iniciace transkripce

55 chloroplastová RNA polymeráza
kódovaná v jádře jeden protein bakteriofágový typ plastidová , , ‘ podjednotky kódovány v chloroplastu  v jádře spolupráce jaderného a chloroplastového genomu vazba na -10 a -35 consenzuální motiv promotoru

56 Iniciace transkripce promotor terminační sekvence jádro plastidy
místa na chromozómu pro vazbu RNA polymerázy TATA box terminační sekvence jádro pro vazbu třeba transkripční faktory obvykle jeden promotor pro jeden gen plastidy vazba RNA polymerázy obvykle bez transkripčních faktorů geny a operony mohou mít mnoho promotorů podobně snad i u mitochondrií

57 DNA transkripce Proces podobný replikaci DNA RNA transkript je krátký
transkript nezůstává spojen s DNA DNA dvojšroubovice se ihned obnovuje RNA transkript je krátký tisíce nukleotidů RNA-polymerázy mohou jít za sebou syntéza další RNA před dokončením prvního transkriptu rychlá tvorba mnoha transkriptů RNA-polymeráza nemá opravnou schopnost

58 Cytoplazmatická mRNA méně stabilní než tRNA a rRNA
posttranskripční úpravy m7G čepička 5‘ konec mRNA připojení guanosinu N-7 metylace nezbytné pro iniciaci translace ochrana před degradací poly A 3‘ polyA polymeráza dosyntetizuje poly adeninový konec A umožňuje export z jádra stabilizuje mRNA proti degradaci nezbytný pro iniciaci translace

59 Plastidová a mitochondriální mRNA
jedna mRNA může nést několik kódujících sekvencí chybí 5‘ čepička i 3‘ poly A mitochondrie 5‘ TP plastidy 5‘ MP některé mají krátký polyA 3‘ konec podporuje degradaci 3‘ i 5‘ konce mohou tvořit smyčky regulační funkce úprava, translace, degradace

60 RNA processing exony introny RNA splicing kódující sekvence
nekódující sekvence jaderná i plastidová, mitochondriální RNA žádné introny u 5.8S, 5S rRNA, snRNA délka jaderné savčí 100b-100kb obvykle nukleotidů u rostlin, bohaté na A-U( 60-70%) v plastidech někdy chybí zcela RNA splicing před opuštěním jádra po přidání čepičky a poly(A) vystřihnutí intronů speciální sekvence několika nukleotidů určuje pozici 5´GU- AG 3 spojení exonů

61 Introny jaderné pre-mRNA <70 G:GU….AG:N jaderná mRNA
délka místa střihu výskyt jaderné pre-mRNA <70 G:GU….AG:N jaderná mRNA jaderné pre-tRNA nekonzervované jaderná tRNA skupina I >200 U:N….G:N plastidová tRNA, rRNA, mRNA skupina II <200 až >400 plastidy a mitochondrie skupina III Euglena obvykle nejsou kratší než 70 bazí bohaté na A-U páry dvouděložné 70% jednoděložné 60%, někdy ale jen 30%

62 Splicing intronů spliceosome lariat uvolněný intron se odbourá
malé jaderné nukleoproteinové částice snRNP snRNA U1, U2, U4/U6 komplex, U5 non snRNP factors lariat guanosin na rozhraní intronu a exonu na 5‘ konci pre-mRNA vytvoří fosfodiesterovou vazbu s 2‘ hydroxylovou skupinu adenosinu uvolněný intron se odbourá introny zvyšují pravděpodobnost rekombinace exonů a tvorby nových proteinů. alternativní sestřih jeden gen dá vznik několika mRNA a různým proteinům

63 Splicing pre-tRNA introny krátké
jen bazí není konzervovaná sekvence střihu obsahují sekvenci komplementární k antikodonu endonukleáza odštěpí intron v blízkosti antikodónu cyklická fosfátová skupina rozštěpena na 2‘ fosfát 5‘ hydroxyl fosforylován RNA ligáza spojí oba konce fosfatáza odstraní 2‘ fosfát

64 Selfsplicing ribozym skupina I skupina II RNA s katalytickou aktivitou
guanosin jako kofaktor skupina II podobný mechanizmus jako pre-tRNA adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu lariat nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

65 Selfsplicing ribozym skupina I skupina II RNA s katalytickou aktivitou
guanosin jako kofaktor skupina II podobný mechanizmus jako pre-tRNA adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu lariat nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

66 Úprava rRNA většina genů transkribována jako prekurzorové RNA a poté upravována pouze některé malé RNA transkribované RNA polymerázou III nejsou upravovány 5S rRNA plastidové rRNA kódované v polycistronické transkripční jednotce obsahující dva geny tRNA s neobvykle dlouhým intronem

67 Úprava tRNA transkribovány RNA polymerázou III
pre-tRNA obsahují nadbytečné sekvence na 3‘ i 5‘ konci odstraňovány nukleázami přidání CCA na 3‘ odstranění intronu

68 Úprava plastidové pre-mRNA
chloroplastový genom obsahuje cca. 150 genů ale jen 60 transkripčních jednotek pre-mRNA polycistronický transkript štěpení na monocistronické mRNA nezbytné pro translaci bakteriální translace polycistronické mRNA mitochondrie transkribují monocistronické pre-mRNA kromě několika vyjímek

69 RNA editting změna sekvence kódující protein
objeveno u mitochondrií trypanozomy změny nukleotidů přidání, odstranění poly U předány z 3‘ guide RNA mitochondrie Trypanozoma, Physarium modifikace, substituce C – U, méně často U – C plastidy, mitochondrie rostlin 1200x na genom v mitochondrii 30x na genom chloroplastu

70 Doba života RNA mRNA se může překládat několikrát
podle množství potřebného proteinu se řídí doba života mRNA. prokaryota 3 min eukaryota 30min až 10 hodin.