Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Nukleové kyseliny Organizace genomu David Kaftan, 2014.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Nukleové kyseliny Organizace genomu David Kaftan, 2014."— Transkript prezentace:

1 Nukleové kyseliny Organizace genomu David Kaftan, 2014

2 Nukleové kyseliny DNA, RNA, centrální dogma DNA – struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962 báze, nukleosidy, nukleotidy primární- komplementarita bazí sekundární- dvoušroubovice terciární – replikace – reparace – mutace RNA – struktura jednošroubovicová mRNA a hnRNA tRNA rRNA snRNA – transkripce a úpravy RNA – translace-proteiny

3 DNA a RNA jsou polymery purinových a pyrimidinových nukleotidů dlouhé, nerozvětvené polymery monomer – nukleotid – purinová nebo pyrimidinová báze – pentosový cukr – fosfátová skupina DNA – 2-deoxyribóza – purin: adenine, guanine – pyrimidin: cytosin, thymin RNA – ribóza přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní – purin: adenine, guanine – pyrimidin: cytosine, uracyl

4 De-novo syntéza pyrimidinů CO 2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu kyselina orotová + fosforibosyl pyrofosfát (PRPP) uridine TP cytidin TP syntéza v plastidech UMP – udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do DNA dTMP – dUMP + methenylhydrofolate – metylace, deaminace dCDP (Lemna major)

5 De-novo syntéza purinů syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním – uhlíků glycin CO 2 formyl a methenyl tetrahydrofolát (THF) – amidové skupiny kyselina asparagová glutamin syntéza v cytosolu

6 Katabolismus a recyklace nukleotidů hydrolýza DNA, RNA – oligonukleotidy – mononukleotidy – nukleosidy, báze syntéza – jednostupňová reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy – dvoustupňová nereverzibilní báze + PRPP  ribonukleotid + PP i báze + (deoxy)ribóza 1-P  (deoxy)nukleosid + P i (deoxy)nukleosid + ATP  (deoxy)nukleotid + ATP

7 Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů kovalentní fosfodiesterová vazba – fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů dva funkční konce – 3‘ volná hydroxylová skupina – 5‘ volná fosfátová skupina

8 Párování bazí v DNA převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice – jedna otočka za 3.4 nm – 10.1 párů bazí na otočku – flexibilní vodíkové vazby mezi vlákny chybí vazby mezi „patry“ A – T – dvě vodíkové vazby G – C – tři vodíkové vazby párování hnáno zvýšením entropie – vznik dvouvlákna snižuje entropii – hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie

9 Alternativní struktury DNA B forma – nejčastější A DNA – dehydratovaná forma – RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice – in vitro, ale i v buňkách Z DNA – levotočivá šroubovice – střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C

10 DNA v jádře je organizována v chromozómech DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny – histony malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA – nehistonové proteiny chromatin – nukleosom dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů H2A, H2B, H3, H4 – solenoid stabilizován histonem H1

11 replikace DNA je semikonzervativní

12 Replikace jaderné DNA iniciace, elongace, terminace S fáze buněčného cyklu iniciace zahájena na několika místech současně – v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby) replikon – celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku – kb rychlost replikace – baktérie 1000 nukleotidů za sekundu – eukaryota 100 nukleotidů za sekundu ukončení replikace při setkání vidliček počátek obsahuje charakteristickou sekvenci kvasinky – 200 bp savci – počátky i 10 kbp od sebe rostliny – není známo

13 Replikace DNA: replikační počátky

14 Replikace jaderné DNA oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T vazba proteinů specifických pro replikaci – DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání dvoušroubovice – replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA – DNA topoizomeráza rozplétá smyčky Primáza – syntéza krátkých segmentů RNA komplementární s DNA DNA polymeráza – připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

15 DNA polymeráza připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě – Okazakiho fragmenty – každý má svůj primer (asi 10 bazí) – dodatečně pospojovány ligázou leading strand - kontinuálně rostoucí řetězec – 1 primer lagging strand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec

16 DNA polymeráza připojování nukleotidů jen za primerem – 3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA α – nesyntetizuje dlouhé fragmenty – 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu – postrádá exonukleázovou aktivitu , ε – spojeno s PCNA – dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů RNAza H – odstraňuje RNA primer záměnou za DNA ligáza – spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu

17 RPA, PCNA replikační protein A (RPA) – heterotrimerní struktura – stabilizace jednovláknové DNA – uvolněny Polα a Pol  proliferating cell nuclear antigen (PCNA) – homotrimerní struktura – spojen s Pol  a replikačním faktorem (Rfc)

18 DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování frekvence chyb 1:10 7 bp polymeráza ve směru 5‘-3‘ nukleáza ve směru 3‘-5‘ – proofreading nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru

19 DNA mismatch repair snižuje chybovost 1:10 7 zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:10 9 ) rozeznání chyby vyštěpení chybné oblasti – jedna baze – celý úsek nemetylované DNA DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec ligáza napojí fragmenty

20 Změny ve struktuře DNA spontánní depurinace deaminace cytosinu – 100 bazí za den a genom thymidinový dimer - UV záření alkylace guaninu stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů většina změn v nekódujících sekvencích

21 Oprava pyrimidinových dimerů dimer indukováno UV světlem oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer excision repair

22 Post-replikační oprava DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bp downstream) homologní rekombinace s komplementárním vláknem vyplnění chybějících částí DNA polymerázami napojení segmentů ligázami

23 Homologní rekombince opravy – uchování nezměněné DNA meióza – zdroj variability – nové kombinace DNA – nové geny, RNA, proteiny – odlišné gamety mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů poměrně časté reciproké vs. genová konverze

24 Homologní rekombinace: single-strand annealing extrachromozomální – plazmidová DNA – T-DNA přerušení obou vláken obou duplexů exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí jednovláknový homologní úsek komplementární úseky jsou přiloženy (annealing) odstranění nehomologních částí oprava mezer nekonzervativní – jen jeden duplex přežije

25 Homologní rekombinace: double-strand break repair meióza přerušení dvou vláken jednoho z duplexů přerušení rozšířeno endonukleázami 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexu kde slouží jako primery ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy

26 Homologní rekombinace: přenos vlákna LIM15 (homolog RecA) synaptonemální komplex

27 Homologní rekombinace: one-sided invasion krátké (žádné) homologní sekvence u rostlin častější než ostatní typy rekombinace traspozonní elementy vmezeření T-DNA přerušení obou vláken akceptorového duplexu přerušení rozšířeno exonukleázami jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního duplexu prodloužení invadujícího vlákna

28 Telomery koncové sekvence chromozómů konzervované repetitivní sekvence telomeráza – obsahuje RNA – rozeznává terminální sekvenci bohatou na G – opakovaně přidává repetitivní sekvence na konec telomery

29 Plastidy jsou endosymbionty DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích

30 Plastidová DNA kruhový chromozóm – velký segment – malý segment – invertovaný opakující se segment chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas – tandemové opakování rRNA Euglena gracilis rozdílné délky – Codium - 89 kb – Acetabularia kb – vyšší rostliny obvykle kb – invertovaný segment: kb

31 Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny kolem 100 genů – většinou všechny rRNA, tRNA – klíčové geny pro enzymy fotosyntézy nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů – kb, cca 40 genů řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře enzymrostlinyřasy fotosyntetizujícíEpifagusEuglenaPorphyra počet Genetický systém rRNArrn4433 tRNAtrn ribozomální protein rps rpl Fotosyntéza Rubisco a dalšírbcL psa psb pet atp NADH dehydrogenáza nhd11000 Biosyntéza počet intronů

32 Mechanismus replikace plastidové DNA mnoho kopií – až 150 – počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu frekvence replikace – nezávislá na buněčném dělení u diferencujících se buněk – synchronní u rychle dělících se buněk replikační počátky poblíž rRNA genů – v invertovaných oblastech u tabáku pravděpodobně i další replikační počátky všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře – helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy, primázy

33 Mitochondriální DNA velká variabilita velikostí – Oenothera, Brassica: 200 kb – Cucumis melo: 2600 kb rozsáhlé nekódující sekvence – Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb – neobsahují opakující se sekvence – živočišné mitochondrie mají malý kompaktní genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí lineární – Chlamydomonas cirkulární – jeden kruhový chromozom Marchantia, Brassica – mnoho subgenomických kruhových chromozómů

34 Homologní rekombinace subgenomických chromozómů dynamika master cycle – subgenomic cycle rekombinace opakujících se sekvencích – 2 isoformy – 2 subgenomické cykly – 3 kombinace subgenomických cyklů

35 Mitochondriální genom malý počet genů oxidativní respirace syntéza ATP translace

36 Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií promiskuitní DNA – obsažena ve více kopiích jádro, mitochondrie, chloroplasty – rostliny, živočichové, houby – není jen jednosměrný transfer – plastidy-jádro, jádro-plastidy plastidový ribozomální protein rpl23 – nahrazen jaderným po inaktivaci původního plastidového – chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23 přenos z chloroplastu do mitochondrií – jednosměrný – mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA

37 Transkripce DNA - geny gen – kódován DNA – kóduje protein protein – DNA - aminokyselina – sekvence aminokyselin -protein – trojrozměrná struktura určuje funkci DNA kód – 4-písmenná abeceda (A,G,C,T) – kódující část genu menší část – nekódující část kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat genom – kompletní genetická informace DNA organismu

38 Organizace plastidového genomu operon – sekvence bakteriálních genů podobného typu transkribovaných najednou polycistronní transktipt – klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné monocistronní transkript – jeden transkript a jeden gen introny – nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci exony – kódující sekvence

39 Organizace jaderného genomu asi jen 1 % DNA je transkribováno počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná gen – promotor – transkribovaná oblast – exony – introny – 3‘ konec nesoucí regulační funkce

40 Organizace jaderného genomu příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně umístění na chromozómu – odděleně – v klastrech, často opakujících se histony: x rRNA:

41 Transposable elements mobilní DNA sekvence – mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu transposonyretrotransposony

42 Bakteriální transposable elements vložené sekvence (insertion sequence elements) – inverted repeat 5‘ GAGC-----GCTC 3‘ 3‘ CTCG-----CGAG 5‘ – 1-2 kb – mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu přesun více méně náhodný přesun jen DNA poměrně vzácně – 1: buněk

43 RNA: primární struktura lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů – adenin, guanin, citosin, uracyl – fosforylovaná ribóza párování s DNA – A-U, T-A, G-C, ale také G-U méně stabilní než DNA – volný 2‘ hydroxyl ribózy heteropolární řetězec – 5‘ začátek – 3‘ konec častá katalytická aktivita váha – S – sedimentační koeficient – Svedberg

44 Sekundární struktura RNA většina tvořena jednotlivými vlákny lokální sekundární struktura – smyčky, vlásenky – výduť – standardní párování G – C, A – U – nestandardní párování G – U, U – U, G – A – volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje vodíkovou vazbu k interakcím interakce domén vytváří terciální struktury

45 RNA je méně stabilní než DNA 2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu – při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu

46 Prekurzorová a mediátorová RNA mRNA – messenger (mediátorová, informační) – kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů – (1-2% celkové buněčné RNA) – nejméně stabilní hnRNA - heterogenní nukleová – pre-mRNA - prekurzorová mRNA vzniklá v jádře, tzv. primární transkript – delší než samotný strukturní gen – různé oblasti DNA exony (kódujicí) introny (nekódujicí) – působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA

47 Transferová RNA tRNA – transferová (přenosová) – přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na ribosom – většina 4S RNA mitochondrie – chybí většina celého setu – import s cytoplazmy chloroplasty – obvykle soběstačné – paraziti importují z cytoplazmy cytoplazma

48 Ribosomální RNA rRNA – ribosomální – součást ribozomu malá podjednotka velká podjednotka – 3 typy ribozomů cytoplasmatické plastidové mitochondriální

49 malé RNA – účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA – RNA splicing: U1, U2,U4-9, U11, U12 – úprava 3‘ histonové mRNA: U7 snoRNA – malé jadérkové RNA – pre rRNA processing scRNA – malé cytoplasmatické RNA cRNA – chromosomová RNA miRNA – mikro RNA – regulace a stabilita translace mRNA telomerázová RNA – templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů 7SL RNA – import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula

50 Genetická informace kódovaná v RNA virus tabákové mozaiky – jednovláknová RNA – proteinový kabátek kódován RNA Gierer a Schramm 1956 – samotná RNA způsobuje infekci Fraenkel-Conrat, Singer 1957 – hybridní virové částice – RNA a cizí protein – nové virové částice obsaohvaly vlastní protein

51 Transkripce DNA na RNA syntéza od 5‘ směrem k 3‘ templátové vlákno DNA přepsáno do komplementárního vlákna RNA – identické s komplementární DNA – uracil místo thyminu RNA polymeráza se pohybuje po DNA ve směru od 3‘ k 5‘

52 RNA polymerázy RNA polymeráza se váže slabě k DNA podobná struktura bakteriálních a eukaryotních polymeráz

53 jaderná RNA polymeráza RNA polymeráza I – jadérko – 25S, 17S a 5.8S rRNA RNA polymeráza, II – nukleoplasma – mRNA, U1, U2, U4, U5 RNA polymeráza III – nukleoplazma – třída 1 5S rRNA – třída 2 tRNA – třída 3 U3, U6, další malé stabilní RNA

54 jaderná RNA polymeráza struktura – dvě velké podjednotky (125 a 220 kDa) – několik dalších malých podjednotek 5 z nich společné všem polymerázám 220 kDa podjednotka RNA polymerázy II – C terminální doména YSPTSPS transkripční faktor II H (TFIIH) – kináza fosforylující Ser, Thr – uvolnění RNA polymerázy II s promotoru iniciace transkripce

55 chloroplastová RNA polymeráza kódovaná v jádře – jeden protein – bakteriofágový typ plastidová – , ,  ‘ podjednotky kódovány v chloroplastu –  v jádře spolupráce jaderného a chloroplastového genomu – vazba na -10 a -35 consenzuální motiv promotoru

56 Iniciace transkripce promotor – místa na chromozómu pro vazbu RNA polymerázy – TATA box terminační sekvence jádro – pro vazbu třeba transkripční faktory – obvykle jeden promotor pro jeden gen plastidy – vazba RNA polymerázy obvykle bez transkripčních faktorů – geny a operony mohou mít mnoho promotorů – podobně snad i u mitochondrií

57 DNA transkripce Proces podobný replikaci DNA – transkript nezůstává spojen s DNA – DNA dvojšroubovice se ihned obnovuje RNA transkript je krátký – tisíce nukleotidů RNA-polymerázy mohou jít za sebou – syntéza další RNA před dokončením prvního transkriptu – rychlá tvorba mnoha transkriptů RNA-polymeráza nemá opravnou schopnost

58 Cytoplazmatická mRNA méně stabilní než tRNA a rRNA posttranskripční úpravy m 7 G čepička – 5‘ konec mRNA – připojení guanosinu – N-7 metylace – nezbytné pro iniciaci translace – ochrana před degradací poly A 3‘ – polyA polymeráza dosyntetizuje poly adeninový konec – A – umožňuje export z jádra – stabilizuje mRNA proti degradaci – nezbytný pro iniciaci translace

59 Plastidová a mitochondriální mRNA jedna mRNA může nést několik kódujících sekvencí chybí 5‘ čepička i 3‘ poly A mitochondrie – 5‘ TP plastidy – 5‘ MP – některé mají krátký polyA 3‘ konec podporuje degradaci 3‘ i 5‘ konce mohou tvořit smyčky – regulační funkce úprava, translace, degradace

60 RNA processing exony – kódující sekvence introny – nekódující sekvence – jaderná i plastidová, mitochondriální RNA – žádné introny u 5.8S, 5S rRNA, snRNA – délka – jaderné savčí 100b-100kb – obvykle nukleotidů u rostlin, bohaté na A-U( 60-70%) – v plastidech někdy chybí zcela RNA splicing – před opuštěním jádra po přidání čepičky a poly(A) – vystřihnutí intronů speciální sekvence několika nukleotidů určuje pozici 5´GU- AG 3 – spojení exonů

61 Introny délkamísta střihuvýskyt jaderné pre-mRNA<70G:GU….AG:Njaderná mRNA jaderné pre-tRNA11-13nekonzervovanéjaderná tRNA skupina I>200U:N….G:Nplastidová tRNA, rRNA, mRNA skupina II 400plastidy a mitochondrie skupina IIIEuglena obvykle nejsou kratší než 70 bazí bohaté na A-U páry – dvouděložné 70% – jednoděložné 60%, někdy ale jen 30%

62 Splicing intronů spliceosome – malé jaderné nukleoproteinové částice snRNP – snRNA – U1, U2, U4/U6 komplex, U5 – non snRNP factors lariat – guanosin na rozhraní intronu a exonu na 5‘ konci pre-mRNA vytvoří fosfodiesterovou vazbu s 2‘ hydroxylovou skupinu adenosinu uvolněný intron se odbourá introny zvyšují pravděpodobnost rekombinace exonů a tvorby nových proteinů. alternativní sestřih – jeden gen dá vznik několika mRNA a různým proteinům

63 Splicing pre-tRNA introny krátké – jen bazí – není konzervovaná sekvence střihu – obsahují sekvenci komplementární k antikodonu endonukleáza odštěpí intron v blízkosti antikodónu cyklická fosfátová skupina rozštěpena na 2‘ fosfát 5‘ hydroxyl fosforylován RNA ligáza spojí oba konce fosfatáza odstraní 2‘ fosfát

64 Selfsplicing ribozym – RNA s katalytickou aktivitou skupina I – guanosin jako kofaktor skupina II – podobný mechanizmus jako pre-tRNA – adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu – lariat – nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

65 Selfsplicing ribozym – RNA s katalytickou aktivitou skupina I – guanosin jako kofaktor skupina II – podobný mechanizmus jako pre-tRNA – adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu – lariat – nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

66 Úprava rRNA většina genů transkribována jako prekurzorové RNA a poté upravována pouze některé malé RNA transkribované RNA polymerázou III nejsou upravovány – 5S rRNA plastidové rRNA kódované v polycistronické transkripční jednotce obsahující dva geny tRNA s neobvykle dlouhým intronem

67 Úprava tRNA transkribovány RNA polymerázou III pre-tRNA obsahují nadbytečné sekvence na 3‘ i 5‘ konci – odstraňovány nukleázami – přidání CCA na 3‘ odstranění intronu

68 Úprava plastidové pre-mRNA chloroplastový genom obsahuje cca. 150 genů ale jen 60 transkripčních jednotek pre-mRNA polycistronický transkript štěpení na monocistronické mRNA – nezbytné pro translaci bakteriální translace polycistronické mRNA mitochondrie transkribují monocistronické pre-mRNA – kromě několika vyjímek

69 RNA editting změna sekvence kódující protein objeveno u mitochondrií trypanozomy změny nukleotidů – přidání, odstranění poly U předány z 3‘ guide RNA – mitochondrie » Trypanozoma, Physarium – modifikace, substituce C – U, méně často U – C plastidy, mitochondrie rostlin – 1200x na genom v mitochondrii – 30x na genom chloroplastu

70 Doba života RNA mRNA se může překládat několikrát podle množství potřebného proteinu se řídí doba života mRNA. prokaryota – 3 min eukaryota – 30min až 10 hodin.


Stáhnout ppt "Nukleové kyseliny Organizace genomu David Kaftan, 2014."

Podobné prezentace


Reklamy Google