Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22"— Transkript prezentace:

1 Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22
Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22

2 Viry Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce
Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena proteinovým kabátem (kapsida) Being alive (virus) vs. living cells DNA – genetická informace RNA – poslíček Ribozomy – translace Proteiny – výroba ATP Membrány – strukturní integrita

3 Morfologie viru Kapsida (kapsidový protein – je kódován virem) NK
Helikální vláknité viry 5-10nm v průměru Dlouhé až 1000nm NK vázáná ze vnitř Ikosaedrické viry Dvacetistěn Kapsida T molekul jednoho proteinu (2-5kb) Kapsida T4 – 240 molekul (pojme přes 10kb) VIRION

4 Morfologie viru Komplexní struktura
Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk) Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein Bakteriofág Ikosaedrická hlavička Šroubovitý bičík Vlákna basální destička

5

6 Variabilita virového světa
Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má genů Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů) Mimiviruses Isoheadrický, 0,75uM 1,2Mbp genom, 900 genů Pandoraviruses Objeveny v roce 2013 Genom 1.9 – 2.5 Mbp 2556 genů

7 Životní cyklus typického viru
Přichycení se viru na hostitelskou buňku Vstup do buňky Pouze NK Celý nukleokapsid Replikace virového genomu Ranné geny Pozdní geny Výroba virových proteinů Sbalení virových částic Uvolnění virů do okolí (smrt hostitelské buňky)

8 Životní cyklus typického viru
Ranné geny jejich promotory připomínají promotory hostitelské buňky kódují proteiny důležité pro replikace Pozdní geny u některých virů jsou tyto geny přepisovány virovou RNA polymerázou kódují proteiny kapsidy Vstup do bunky: receptor or carbohydrate, very often it is glycoprotein Only the genetic material enters the cell

9 Variabilita virového světa
DNA viry Replikují se DNA polymerázou ssDNA dsDNA RNA viry Replikují se vlastní RNA dependentní RNA polymerázou, či reverzní transkriptázou ssRNA Plusový (pozitivní) řetězec Záporný (negativní) řetězec dsRNA Lineární nebo cirkulární Replikace pomocí otáčivé kružnice u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA

10 Variabilita virového světa

11 RNA viry Výhody Nevýhody + RNA vlákno je ihned připraveno k translaci
k replikaci doachází v cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých enzymů na úpravu RNA) Nevýhody RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP= RNA replikáza nevyskytuje se v buňce a tím pádem se nemohou spoléhat na buněčný aparát Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do kapsidy Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb Maximální velikost genomu je 20kb

12 Replikační strategie RNA virů
Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza V cytoplasmě Obvykle kódují 3-8 proteinů Problémy: Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné Polyproteinová strategie (autokatalytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry) Ignorace stop kodónů a start kodónů Subgenomová mRNA (alphaviry) Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP – 2000AA, polyfunkční) Replikace virové RNA RNAP Fungují současně jako helikázy a SSB

13 RNA viry baktérií Nejmenší genomy vůbec Pouze 3 geny (4 proteiny)
Kapsidový protein RNA replikáza Lytické proteiny (A1,A2), který lyzuje bakteriální stěnu Příklad: Bakteriofág Qβ, infikuje E. coli ssRNA (+), 4700bp

14 Pozitivní ss RNA viry Picornaviry
Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka 12 genů RNA (+) vlákno je využíváno k translaci (bezčepičková translace) Má 3‘ poly A konec 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů

15 Repilkační cyklus alphaviru - ss (+) RNA virus
Průnik do buňky endocytózou Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy 1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán nsP1 – syntéza negativního vlákna nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje transkripci hostitele nsP3 – replikáza nsP4 – RNAP Syntéza celého minus vlákna templát pro syntézu subgenomické RNA polyprotein C-pE2-6K-E1 genomické RNA Sbalení virové částice a vypučení ven The Alphavirus life cycle is depicted in the figure. Alphaviruses enter target cells by endocytosis33. A few receptors (for example, dendritic cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin 1 (DC-SIGN; also known as CD209), liver and lymph node-SIGN (L-SIGN; also known as CLEC4M), heparan sulphate, laminin and integrins) have been implicated in this process, but their precise roles have not been firmly established33. Following endocytosis, the acidic environment of the endosome triggers conformational changes in the viral envelope that expose the E1 peptide90, 135, which mediates virus–host cell membrane fusion. This allows cytoplasmic delivery of the core and release of the viral genome6, 29, 136. Two precursors of non-structural proteins (nsPs) are translated from the viral mRNA, and cleavage of these precursors generates nsP1–nsP4. nsP1 is involved in the synthesis of the negative strand of viral RNA and has RNA capping properties33, 137, nsP2 displays RNA helicase, RNA triphosphatase and proteinase activities and is involved in the shut-off of host cell transcription138, nsP3 is part of the replicase unit and nsP4 is the viral RNA polymerase33. These proteins assemble to form the viral replication complex, which synthesizes a full-length negative-strand RNA intermediate. This serves as the template for the synthesis of both subgenomic (26S) and genomic (49S) RNAs. The subgenomic RNA drives the expression of the C–pE2–6K–E1 polyprotein precursor, which is processed by an autoproteolytic serine protease. The capsid (C) is released, and the pE2 and E1 glycoproteins are generated by further processing. pE2 and E1 associate in the Golgi and are exported to the plasma membrane, where pE2 is cleaved into E2 (which is involved in receptor binding) and E3 (which mediates proper folding of pE2 and its subsequent association with E1). Viral assembly is promoted by binding of the viral nucleocapsid to the viral RNA and the recruitment of the membrane-associated envelope glycoproteins. The assembled alphavirus particle, with an icosahedral core, buds at the cell membrane. Biology and pathogenesis of chikungunya virus Olivier Schwartz & Matthew L. Albert

16 Negativní ss RNA viry Evolučně velmi mladá skupina virů
Velmi virulentní Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc. Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky Musí si přinést svou RNP komplexy Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované repetice bp dlouhé N-P-M-G-L geny (na + řetězci) Protein N povrch kapsidy Anti-terminační účinky Až 100x více než proteinu G Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus Jianrong Li1, 2, 3 and Yu Zhang1

17 dsRNA viry dsRNA viry Poměrně vzácné
Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein Rotaviry Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy

18 DNA viry Replikují se v jádře buňce a využívají běžných buněčných mechanismů pro replikaci a transkripci Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých okolností a v omezeném spektru tkání Většinou je infekce latentní Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující k neomezenému množení Začlenění DNA viru do genomické DNA

19 dsDNA viry dsDNA viry baktérií dsDNA viry vyšších organismů
typický baktériofág T4, lambda, P1, Mu dsDNA viry vyšších organismů Papaoviry (polyoma a papiloma) Nejmenší dsDNA viry (5kb) T-antigen Protein ovlivňující buněčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze) Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů Herpesvirus Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb) Obrovský arsenál vlastních proteinů Latentní herpesviry virus způsobující rakovinu u opic

20 DNA viry dsDNA viry vyšších organismů dsDNA viry rostlin Poxvirus
Velmi komplexní (150 – 200 genů) viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM) K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus) V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP dsDNA viry rostlin Poměrně vzácné CMV virus – cauliflower mosaic virus

21 Bakteriální virus - bakteriofág
Objeveny v roce 1917 Phage – řecké slovo pro „ jíst“ Využívány hojně v molekulární biologii Bakteriofág  - nejvíce studovaný organismus Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že DNA je nositelem genetické informace Fágové – nejpočetnější skupina živé formy 1030 baktérií, každá má 10 fágů 1031 fágů Mořská voda – 50x106 virů na 1 ml Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku

22 Životní cyklus bakteriofága
Navázání se na buňku Vstup do buňky Vstupuje pouze DNA/RNA Replikace virového genomu Výroba virových proteinů Sbalení nových virových částic Uvolnění z buňky Vstup do bunky: receptor or carbohydrate, very often it is glycoprotein Only the genetic material enters the cell

23 Expresní strategie dsDNA fágů
95% všech fágů je ds DNA Proces infekce: Časná fáze Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP Transkripční geny Geny interferující s restričkním systémem baktérií Proteiny zabraňující superinfekci Střední fáze Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů Pozdní fáze Intesivní replikace fágové DNA Silná exprese kapsidových proteinů

24 Lytický vs latentní cyklus
LYSIS LYSOGENIC cro je ON/ cI je OFF cro je OFF/ cI je ON Exprese fágových genů je ON Exprese fágových genů je OFF 20-40 minut 10 – 100 fágů Plak 4-10mm Virus integrovaný do genomu – provirus, prophage Integrace do genomu může být přes definovaná místa ( attachment site), nebo náhodná

25

26 Louis Pasteur ( 1822 – 1895) Zakladatel moderni lékařské mikrobiologie
pasterizace/sterilizace podpora teorie, že za nemocí stojí choroboplodné zárodky První vakcinace za použití laboratorně oslabeného organismu (viru, či bakterie) Vakcína proti anthrax a vzteklině

27 Eradikace neštovice Edward Jenner (1749 – 1823)
Virus Variola major, V. minor Vaccinace=vacca=kráva 20. století – milion lidí umírá – poslední případ eradikace 1986 – konec očkování 2 vzorky stále na světě (CDC, Atlanta a State Research Center for Virogology, Koltsovo, Russia) Nebezpečí použití jako biologické zbraně

28

29 Vítězství nad obrnou Jonas Salk (1914 – 1955) virolog
Vakcína proti dětské obrně Obrna patřila mezi nejobávanější nemoci poválečných let 1952 – případů obrny 1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší vůbec ( dětí se účastnilo testů) vakcína funguje 1962 – orální vakcína (Albert Sabin)

30 Mobilní elementy - transpozony
Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jádra (přesun na různé chromozómy Skákající geny, mobilní elementy, kontrolující elementy atd. proces je nazýván transpozice Transpozony nejsou nikdy samostatně Transpozony DNA RNA - Retroposony Způsoby transpozice Konzervativní (cut and paste) Replikativní (copy and paste)

31 DNA transpozon Inverzní repetice na svých koncích
9-40 bází ORF 1kb – transponáza Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon na buňku Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou 3-9bp Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika, virulentní geny, metabolické geny 750 nt – 15,000 nt

32 Cut and paste transpozice
Konzervativní (nereplikativní)

33 Cut and copy transpozice
Replikativní (nekonzervativní) Více komplexní transpozice Resolváza rozeznáva interní místo (cílovou sekvenci) Částečně palindromická sekvence 30-40bp Dochází k replikaci transponózu

34 Cut and copy transpozice
transponáza transponáza resolváza

35 Bakteriální transpozony
1. transpozóny, u nichž byla definována molekulární podstata Nejjednodušší transpozóny Inserční sekvence – IS IS1, IS2 atd. 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce jsou 10 – 40bp Pouze cut-paste transpozice Transponóza je exprimována pouze, když dojde k posunu o jednu bázi – ne moc běžné Jinak exprese regulačního proteinu A – transkripční reulátor Neregulovaná transpozice by vedla ke zničení chromozómu

36 Regulace transpozice Tn10
Bakteriální transpozón Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin Transpozice nereplikativním způsobem Transpozice je silně regulována Antisense RNA (transript z Pout se překrývá s Pin) Mutace transponázy v IS1 OL Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy DNA není methylována) Transponáza zmutovaná 1-10% aktivity Transponáza plně funkční

37 Bakteriofág Mu Virus vs transpozón Genom 38kb
Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní transpozice Promotory replikačních genů jsou zareprimovány represorem Fág je stabilní a nepřesouvá se Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí si až 100x Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových proteinů

38 Transposony vyšších organismů
Barbara McClintock (Nobelova cena v roc 1983) Experimenty s kukuřicí (maize) Ac/Ds rodina transpozonů Ac – aktivátor Ds - disociátor Repetitivní konce 11 bazí Cílová sekvence – 8bp Ac element je 4500bp, plně funkční Ds element je defektni Ac element

39 Další typy DNA transpozónů
P elements – Drosophilla melanogaster Objeveny Margaret Kidwell při studui hybdridní dysgeneze M kmen – v laboratoři od 1905 P kmen – v přírodě Křížením M kmene (samice) a P kmene (samce) – sterilní potmostvo V M kmenech v somatických buňkách se translatuje represor P elementy jsou využívány v genetice Vypínání genů Taggovaní genů Příprava mutantů

40

41 Další typy DNA transpozónů
Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ transpozónu Sleeping beauty transpozon (usnul před milióny let) Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutované a nefunkční Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce

42 RNA transpozóny - retroposony
Původní RNA transkripty, která se reverzní transkripcí změnily na DNA a integrovaly se zpět do chromozómů Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si vlastní reverzní transkriptázu (RT) Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA, která musí být přepsána do cDNA Transponová RNA je v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici do vzdálených míst Musí kódovat transponázu Musí kódovat RT Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji Virová (LTR) nadrodina LTR – long terminal repeats Nevirová (non LTR) nadrodina U rostlin a živočichů představují až 50% genomu

43 LTR retroposony Objeveny Geery Finkem v 80. letech
Kvasinkový systém, mutace v His4 genu (1500 různých, dvě revertují) Ty elementy kvasinky Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5 Jejich transkripty představují as 5% veškeré mRNA v buňce ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR Frekvence transpozice 10-7 az 10-8 Velmi podobné retrovirům, jen nemají (ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env Copia elementy D. melanogaster ~5000bp, 276 dlouhé LTR 20 – 60 kopií na buňku Frekvence transpozice 10-3 az 10-4

44 LTR retroposony

45 LTR retroposony

46 Retroviry Vir obsahuje ssRNA (pozitivní) Především u ptáků a savců
V hostitelské buňce může být integrován do DNA Reverzní transkriptáza Nejpůvodnější a nejprimitivbější Je velmi pomalá a chybující, bez korektury Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita) Některé retroviry jsou původci rakovinných změn v lidském těle

47 Replikační cyklus retroviru
Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA Virus si přináší reverzní transkriptázu Integrázu tRNA integráza Reverzní transkriptáza

48 Genom retroviru Gag – kapsidové proteiny Pol – enzymy
Env – obalové proteiny Proteáza Matrixový Reverzní transkriptáza povrchový protein Kapsidový Transmembránový protein Nukleokapsidový – váže virovou RNA integráza Unikátní U5 sekvence + PBS sekvence Silný promotor v U3 oblasti Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou

49 All three classes of virus replicate through positive-strand RNA ((+)RNA) intermediates (red strands in the figure) that are templates for both translation and genome replication. For each class, the figure shows a simplified, representative life cycle. Double-stranded (ds)RNA viruses As shown in part a of the figure, virus attachment and endocytosis deliver a virion core that contains viral genomic dsRNA and viral RNA polymerase (yellow) into the cytoplasm. The core transcribes and extrudes (+)mRNAs that are first translated (1) and then packaged (2) by the resulting viral proteins into new virion cores. Cores mature by synthesizing negative-strand (-)RNA (dotted strand) and adding exterior proteins. They exit by cell lysis or secretion. (+)RNA viruses As shown in part b of the figure, endocytosed virions release messenger-sense genomic RNA into the cytoplasm for translation. Newly translated viral RNA-replication proteins recruit this genomic RNA into a membrane-associated, intracellular RNA-replication complex. Small amounts of (-)RNA are produced and used as templates to greatly amplify viral (+)RNA, which is encapsidated into new progeny virions. Retroviruses As shown in part c of the figure, virion attachment and envelope fusion release a subviral complex that contains viral genomic (+)RNA and reverse transcriptase (yellow). After cDNA synthesis by reverse transcription, proviral cDNA is integrated into the host chromosome and transcribed to produce (+)RNA that is translated (1) and then packaged (2) into new virions that are released by budding.

50 Non LTR retroposony Nevirové Sestřihové pseudogeny
Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T) Nejsou funkční nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka) LINES – long interspersed nuclear sequences SINES – short interspersed nuclear sequences

51 LINES Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III
Jsou velmi hojné, velmi příbuzné K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii) 2 ORF RNA vazebný protein RT s nukleázou

52 SINES Nejznámější tzv. Alu sekvence (200bp)
cDNA kopie transkriptů RNAP III (připomínají sekvence 7SL RNA) Až milióny kopií v genomu 10% genomu Tvoří významnou část repetitivní DNA jsou náhodně roztroušené

53 Význam transpozónů v lidském genomu

54 C-paradox Chybí korelace mezi velikostí genomu a biologickou komplexností

55 ssDNA viry baktérií Bakteriofág X174 Bakteriofág M13 5386 bp, 11 genů
5 genů se překrývá Gen D a gen E Gen D důležitý pro sbalení kapsidy Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky Bakteriofág M13 Dlouhé filamentum Infikuje pouze F baktérie M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA

56 Replikace retrovirů RNA DNA PBS sekvence Spárování
Strong stop minus DNA Dlouhý usek pyrimidinů, který není schopna RT rozštípat


Stáhnout ppt "Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22"

Podobné prezentace


Reklamy Google