Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22."— Transkript prezentace:

1 Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22

2 Viry Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena proteinovým kabátem (kapsida) Being alive (virus) vs. living cells DNA – genetická informace RNA – poslíček Ribozomy – translace Proteiny – výroba ATP Membrány – strukturní integrita

3 Morfologie viru Kapsida (kapsidový protein – je kódován virem) NK Helikální vláknité viry 5-10nm v průměru Dlouhé až 1000nm NK vázáná ze vnitř Ikosaedrické viry Dvacetistěn Kapsida T molekul jednoho proteinu (2-5kb) Kapsida T4 – 240 molekul (pojme přes 10kb) VIRION

4 Komplexní struktura Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk) Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein Bakteriofág Ikosaedrická hlavička Šroubovitý bičík Vlákna basální destička Morfologie viru

5

6 Variabilita virového světa Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má genů Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů) Mimiviruses Isoheadrický, 0,75uM 1,2Mbp genom, 900 genů Pandoraviruses Objeveny v roce 2013 Genom 1.9 – 2.5 Mbp 2556 genů

7 Životní cyklus typického viru Přichycení se viru na hostitelskou buňku Vstup do buňky Pouze NK Celý nukleokapsid Replikace virového genomu Ranné geny Pozdní geny Výroba virových proteinů Sbalení virových částic Uvolnění virů do okolí (smrt hostitelské buňky)

8 Ranné geny jejich promotory připomínají promotory hostitelské buňky kódují proteiny důležité pro replikace Pozdní geny u některých virů jsou tyto geny přepisovány virovou RNA polymerázou kódují proteiny kapsidy Životní cyklus typického viru

9 Variabilita virového světa DNA viry Replikují se DNA polymerázou ssDNA dsDNA RNA viry Replikují se vlastní RNA dependentní RNA polymerázou, či reverzní transkriptázou ssRNA Plusový (pozitivní) řetězec Záporný (negativní) řetězec dsRNA Lineární nebo cirkulární Replikace pomocí otáčivé kružnice u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA

10 Variabilita virového světa

11 RNA viry Výhody + RNA vlákno je ihned připraveno k translaci k replikaci doachází v cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých enzymů na úpravu RNA) Nevýhody RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP= RNA replikáza nevyskytuje se v buňce a tím pádem se nemohou spoléhat na buněčný aparát Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do kapsidy Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb Maximální velikost genomu je 20kb

12 Replikační strategie RNA virů Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza V cytoplasmě Obvykle kódují 3-8 proteinů Problémy: Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné Polyproteinová strategie (autokatalytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry) Ignorace stop kodónů a start kodónů Subgenomová mRNA (alphaviry) Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP – 2000AA, polyfunkční) Replikace virové RNA RNAP Fungují současně jako helikázy a SSB

13 RNA viry baktérií Nejmenší genomy vůbec Pouze 3 geny (4 proteiny) Kapsidový protein RNA replikáza Lytické proteiny (A1,A2), který lyzuje bakteriální stěnu Příklad: Bakteriofág Qβ, infikuje E. coli ssRNA (+), 4700bp

14 Pozitivní ss RNA viry Picornaviry Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka 12 genů RNA (+) vlákno je využíváno k translaci (bezčepičková translace) Má 3‘ poly A konec 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů

15 Repilkační cyklus alphaviru - ss (+) RNA virus Biology and pathogenesis of chikungunya virus Olivier Schwartz & Matthew L. Albert Průnik do buňky endocytózou Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy 1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán nsP1 – syntéza negativního vlákna nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje transkripci hostitele nsP3 – replikáza nsP4 – RNAP Syntéza celého minus vlákna templát pro syntézu subgenomické RNA polyprotein C-pE2-6K-E1 templát pro syntézu genomické RNA Sbalení virové částice a vypučení ven

16 Negativní ss RNA viry Evolučně velmi mladá skupina virů Velmi virulentní Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc. Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky Musí si přinést svou RNP komplexy Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované repetice bp dlouhé N-P-M-G-L geny (na + řetězci) Protein N povrch kapsidy Anti-terminační účinky Až 100x více než proteinu G Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus Jianrong Li 1, 2, 3 and Yu Zhang 1

17 dsRNA viry Poměrně vzácné Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein Rotaviry Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy

18 DNA viry Replikují se v jádře buňce a využívají běžných buněčných mechanismů pro replikaci a transkripci Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých okolností a v omezeném spektru tkání Většinou je infekce latentní Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující k neomezenému množení Začlenění DNA viru do genomické DNA

19 dsDNA viry dsDNA viry baktérií typický baktériofág T4, lambda, P1, Mu dsDNA viry vyšších organismů Papaoviry (polyoma a papiloma) Nejmenší dsDNA viry (5kb) T-antigen Protein ovlivňující buněčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze) Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů Herpesvirus Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb) Obrovský arsenál vlastních proteinů Latentní herpesviry

20 dsDNA viry vyšších organismů Poxvirus Velmi komplexní (150 – 200 genů) viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM) K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus) V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP dsDNA viry rostlin Poměrně vzácné CMV virus – cauliflower mosaic virus DNA viry

21 Bakteriální virus - bakteriofág Objeveny v roce 1917 Phage – řecké slovo pro „ jíst“ Využívány hojně v molekulární biologii Bakteriofág - nejvíce studovaný organismus Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že DNA je nositelem genetické informace Fágové – nejpočetnější skupina živé formy baktérií, každá má 10 fágů fágů Mořská voda – 50x10 6 virů na 1 ml Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku

22 Životní cyklus bakteriofága Navázání se na buňku Vstup do buňky Vstupuje pouze DNA/RNA Replikace virového genomu Výroba virových proteinů Sbalení nových virových částic Uvolnění z buňky

23 Expresní strategie dsDNA fágů 95% všech fágů je ds DNA Proces infekce: Časná fáze Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP Transkripční geny Geny interferující s restričkním systémem baktérií Proteiny zabraňující superinfekci Střední fáze Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů Pozdní fáze Intesivní replikace fágové DNA Silná exprese kapsidových proteinů

24 Lytický vs latentní cyklus minut 10 – 100 fágů Plak 4-10mm cro je ON/ cI je OFF LYSIS Exprese fágových genů je ON Exprese fágových genů je OFF LYSOGENIC cro je OFF/ cI je ON Virus integrovaný do genomu – provirus, prophage Integrace do genomu může být přes definovaná místa ( attachment site), nebo náhodná

25

26 Louis Pasteur ( 1822 – 1895)  Zakladatel moderni lékařské mikrobiologie  pasterizace/sterilizace  podpora teorie, že za nemocí stojí choroboplodné zárodky  První vakcinace za použití laboratorně oslabeného organismu (viru, či bakterie)  Vakcína proti anthrax a vzteklině

27 Eradikace neštovice  Edward Jenner (1749 – 1823)  Virus Variola major, V. minor  Vaccinace=vacca=kráva  20. století – milion lidí umírá  – poslední případ  eradikace  1986 – konec očkování  2 vzorky stále na světě (CDC, Atlanta a State Research Center for Virogology, Koltsovo, Russia)  Nebezpečí použití jako biologické zbraně

28

29 Vít ě zství nad obrnou  Jonas Salk (1914 – 1955)  virolog  Vakcína proti dětské obrně  Obrna patřila mezi nejobávanější nemoci poválečných let  1952 – případů obrny  1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší vůbec ( dětí se účastnilo testů)  vakcína funguje  1962 – orální vakcína (Albert Sabin)

30 Mobilní elementy - transpozony Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jádra (přesun na různé chromozómy Skákající geny, mobilní elementy, kontrolující elementy atd. proces je nazýván transpozice Transpozony nejsou nikdy samostatně Transpozony DNA RNA - Retroposony Způsoby transpozice Konzervativní (cut and paste) Replikativní (copy and paste)

31 DNA transpozon Inverzní repetice na svých koncích 9-40 bází ORF 1kb – transponáza Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon na buňku Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou 3-9bp Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika, virulentní geny, metabolické geny 750 nt – 15,000 nt

32 Cut and paste transpozice Konzervativní (nereplikativní)

33 Replikativní (nekonzervativní) Více komplexní transpozice Resolváza rozeznáva interní místo (cílovou sekvenci) Částečně palindromická sekvence 30-40bp Dochází k replikaci transponózu Cut and copy transpozice

34 transponáza resolváza

35 Bakteriální transpozony 1. transpozóny, u nichž byla definována molekulární podstata Nejjednodušší transpozóny Inserční sekvence – IS IS1, IS2 atd. 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce jsou 10 – 40bp Pouze cut-paste transpozice Transponóza je exprimována pouze, když dojde k posunu o jednu bázi – ne moc běžné Jinak exprese regulačního proteinu A – transkripční reulátor Neregulovaná transpozice by vedla ke zničení chromozómu

36 Regulace transpozice Tn10 Bakteriální transpozón Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin Transpozice nereplikativním způsobem Transpozice je silně regulována Antisense RNA (transript z P out se překrývá s P in ) Mutace transponázy v IS1 OL Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy DNA není methylována) Transponáza zmutovaná 1-10% aktivity Transponáza plně funkční

37 Bakteriofág Mu Virus vs transpozón Genom 38kb Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní transpozice Promotory replikačních genů jsou zareprimovány represorem Fág je stabilní a nepřesouvá se Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí si až 100x Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových proteinů

38 Transposony vyšších organismů Barbara McClintock (Nobelova cena v roc 1983) Experimenty s kukuřicí (maize) Ac/Ds rodina transpozonů Ac – aktivátor Ds - disociátor Repetitivní konce 11 bazí Cílová sekvence – 8bp Ac element je 4500bp, plně funkční Ds element je defektni Ac element

39 Další typy DNA transpozónů P elements – Drosophilla melanogaster Objeveny Margaret Kidwell při studui hybdridní dysgeneze M kmen – v laboratoři od 1905 P kmen – v přírodě Křížením M kmene (samice) a P kmene (samce) – sterilní potmostvo V M kmenech v somatických buňkách se translatuje represor P elementy jsou využívány v genetice Vypínání genů Taggovaní genů Příprava mutantů

40

41 Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ transpozónu Sleeping beauty transpozon (usnul před milióny let) Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutované a nefunkční Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce Další typy DNA transpozónů

42 RNA transpozóny - retroposony Původní RNA transkripty, která se reverzní transkripcí změnily na DNA a integrovaly se zpět do chromozómů Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si vlastní reverzní transkriptázu (RT) Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA, která musí být přepsána do cDNA Transponová RNA je v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici do vzdálených míst Musí kódovat transponázu Musí kódovat RT Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji Virová (LTR) nadrodina LTR – long terminal repeats Nevirová (non LTR) nadrodina U rostlin a živočichů představují až 50% genomu

43 LTR retroposony Objeveny Geery Finkem v 80. letech Kvasinkový systém, mutace v His4 genu (1500 různých, dvě revertují) Ty elementy kvasinky Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5 Jejich transkripty představují as 5% veškeré mRNA v buňce ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR Frekvence transpozice az Velmi podobné retrovirům, jen nemají (ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env Copia elementy D. melanogaster ~5000bp, 276 dlouhé LTR 20 – 60 kopií na buňku Frekvence transpozice az 10 -4

44 LTR retroposony

45

46 Retroviry Vir obsahuje ssRNA (pozitivní) Především u ptáků a savců V hostitelské buňce může být integrován do DNA Reverzní transkriptáza Nejpůvodnější a nejprimitivbější Je velmi pomalá a chybující, bez korektury Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita) Některé retroviry jsou původci rakovinných změn v lidském těle

47 Replikační cyklus retroviru Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA Virus si přináší reverzní transkriptázu Integrázu tRNA Reverzní transkriptáza integráza

48 Gag – kapsidové proteiny Matrixový Kapsidový Nukleokapsidový – váže virovou RNA Pol – enzymy Proteáza Reverzní transkriptáza integráza Env – obalové proteiny povrchový protein Transmembránový protein Genom retroviru Unikátní U5 sekvence + PBS sekvenceSilný promotor v U3 oblasti Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou

49

50 Non LTR retroposony Nevirové Sestřihové pseudogeny Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T) Nejsou funkční nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka) LINES – long interspersed nuclear sequences SINES – short interspersed nuclear sequences

51 LINES Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III Jsou velmi hojné, velmi příbuzné K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii) 2 ORF RNA vazebný protein RT s nukleázou

52 SINES Nejznámější tzv. Alu sekvence (200bp) cDNA kopie transkriptů RNAP III (připomínají sekvence 7SL RNA) Až milióny kopií v genomu 10% genomu Tvoří významnou část repetitivní DNA jsou náhodně roztroušené

53 Význam transpozónů v lidském genomu

54 C-paradox Chybí korelace mezi velikostí genomu a biologickou komplexností

55 ssDNA viry baktérií Bakteriofág  X bp, 11 genů 5 genů se překrývá Gen D a gen E Gen D důležitý pro sbalení kapsidy Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky Bakteriofág M13 Dlouhé filamentum Infikuje pouze F baktérie M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA

56 Replikace retrovirů PBS sekvence Strong stop minus DNA RNA DNA Spárování Dlouhý usek pyrimidinů, který není schopna RT rozštípat


Stáhnout ppt "Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22."

Podobné prezentace


Reklamy Google