Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Č echák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Č echák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV."— Transkript prezentace:

1 Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Č echák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV a 3 LF UK 2006/2007

2 Fáze laboratorního vyšetření :  preanalytická - definována jako postupy a operace od požadavku na vyšetření až po zahájení analýzy vzorku, tj. skládá se z přípravy nemocného na odběr vyšetření, odběru biologického materiálu, jeho uchování a transportu do laboratoře  analytická - je prováděna v laboratoři v souladu s postupy správné laboratorní praxe - zahrnuje vnitřní a vnější kontrolu kvality, které by měly minimalizovat chyby analytického procesu  postanalytická - Jedná se o interpretaci výsledků stanovení ve vztahu k fyziologickým hodnotám (bývají udávány jako referenční meze), k výsledkům dalších vyšetření laboratorního komplementu a zobrazovacích metod a ke klinickému obrazu pacienta (anamnéze, objektivnímu nálezu)

3 Č asové rozd ě lení jednotlivých fází biochemického vyšet ř ení

4 Analytická fáze laboratorního vyšet ř ení  Jedná se o tu část laboratorního vyšetření, která je doménou laboratoře, tj. o vlastní analýzu.  Je zajišťována analytickými chemiky, biochemiky a zdravotními laboranty a prováděna v souladu s postupy správné laboratorní praxe (interní a externí kontrola kvality).  Stanovení daného analytu může být prováděno celou řadou metodik, tj. analytických postupů, které ovšem mohou mít různou vypovídací hodnotu. S rozvojem řady technologií v našem století se přesnost a spolehlivost metod výrazně zvýšila. Příkladem může být stanovování stopových prvků, kdy v průběhu dvaceti let normální hodnoty poklesly až stonásobně.

5 Druhy biologického materiálu v laboratoři :  sérum - na ž loutlá tekutina, která vzniká po sražení krve (krevní buňky s některými bílkovinami vytvoří koagulum a s. je vytlačeno ven). Je podobné plasm ě, ale neobsahuje některé bílkoviny, které jsou nutné ke vzniku sraženiny a které se při její tvorbě spotřebovaly  plasma - nažloutlá tekutina, která je spolu s krvinkami v ní obsaženými základem krve. Obsahuje 90 % vody, 8 % bílkovin (albumin, globuliny, fibrinogen, koagulační faktory, imunoglobuliny aj.), soli, glukosu, lipidy, žlučová barviva, hormony, vitaminy, odpadní látky aj.  - lze získat odstředěním nesrážlivé krve, tj. krve odebrané do stříkačky nebo zkumavky obsahující protisrážlivé látky – citrát nebo heparin  punktát – materiál získaný punkcí  mo č  likvor  stolice  slzy

6 Metody (podle principu) :  chemické  fyzikální  imunochemické  m. vyšet ř ování nukleových kyselin  chromatografické

7 Metody chemické :  optické  elektrochemické  elektroforetické

8 Metody optické :  Absorp č ní fotometrie – zabývá se kvantitativním hodnocením zm ě ny intenzity zá ř ení po pr ů chodu analytickým prost ř edím – absorbance je p ř ímo úm ě rná látkové koncentraci a tlouš ť ce absorbující vrstvy – platí Lambertův-Beerův-Bougnerův zákon : A = a. c. l A... absorbance a... absorpční koeficient pro danou λ (vlnová délka) c... koncentrace roztoku l... délka optické dráhy (tloušťka vrstvy roztoku) - přístroje : - jednopaprskové - absorpční fotometry - dvoupaprskové roztok spektrofotometry blank (slepá zkouška) s rozvojem automatických analyzátorů výzkum

9 Metody optické – pokračování :  Reflexní fotometrie – sleduje se odra ž ené zá ř ení od homogenn ě zbarvené podlo ž ky - pou ž ití : pro kvantitativní vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi se suchými č inidly po jejich aktivaci vodou obsa ž enou v m ěř eném vzorku  Plamenová emisní fotometrie – m ěř í se intenzita zbarvení plamene, k emisi zá ř ení charakteristické délky dochází p ř i návratu elektron ů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) na p ů vodní dráhy pou ž ití : pro stanovení koncentrace sodných a draselných iont ů v séru č i v mo č i, lithia a vápníku nátrémie - závislá na obsahu bílkovin a lipidů v plazmě kde se patologicky zvyšují falešně snížená nátrémie (tzv. pseudohyponátrémie)

10 Metody optické – pokračování :  Fluorimetrie – vyu ž ívá se jevu, kdy v n ě kterých látkách po ozá ř ení dostate č n ě energetickým zdrojem sv ě tla vzniká fotoluminiscence; látky p ř i tom vyza ř ují sv ě tlo, jeho ž intenzita je p ř ímo úm ě rná koncentraci fluoreskující slou č eniny Pou ž ití : zejména pro detekci v imunochemii  Turbidimetrie – zalo ž ená na m ěř ení procházejícího sv ě tla zeslabeného rozptylem na č ásticích –měří se stupeň zákalu - turbidita - pou ž ití : imunochemické metody  Nefelometrie – m ěř ení intenzity difuzn ě rozptýleného sv ě tla na dispergovaných č ásticích –rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření - pou ž ití : pro reakce antigen-protilátka, je o ř ád citliv ě jší ne ž turbidimetrie

11 Metody optické – pokračování :  Chemiluminiscence – excitace foton ů je vyvolána chemickou reakcí, která prob ě hne bu ď po nást ř iku syntetizovaného č inidla, nebo se pou ž ije biologická substance (bioluminiscence) nebo se k excitaci č inidel vyu ž ívá oxidace na anod ě (elektrochemiluminiscence) –přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise

12 Elektrochemické metody :  Potenciometrie – m ěř í se rozdíl potenciál ů (nap ě tí) mezi dv ě ma elektrodami; jedna elda – referen č ní (srovnávací) – konstantní potenciál; druhá elda – indika č ní (m ě rná) – potenciál závisí na aktivit ě m ěř eného analytu ve zkoumaném vzorku - pou ž ití : stanovení sodných, draselných, lithných, vápenatých, ho ř e č natých a amonných kationt ů, chloridových aniont ů a oxid uhli č itý - pH - astrup - skleněná elda - ISE  Ampérometrie – m ěř ení proudu za konstantního potenciálu - amperometr slou ž í jako detektor elektron ů v oxida č n ě -reduk č ních reakcích p ř i stanovení glukozy, sleduje se mno ž ství elektron ů uvoln ě ných p ř i doprovodné reakci Fe 2+ Fe 3+ + e - všechny moderní glukometry

13 Elektrochemické metody - pokračování :  Polarografie – m ěř í se intenzita proudu p ř i konstantním vn ě jším potenciálu (p ř ep ě tí) Clarkova Elda – slou ž í ke stanovení mno ž ství kyslíku; kyslík rozpušt ě ný ve vzorku nebo v pufru difunduje p ř es hydrofobní membránu propustnou pro plyny ke katod ě (z platiny), jako anoda slou ž í Ag/AgCl elda; pou ž ití u acidobazických analyzátor ů k m ěř ení parciálního tlaku kyslíku  Coulometrie – ke stanovení koncentrace v roztoku se pou ž ívá m ěř ení prošlého náboje p ř i elektrochemické reakci - pou ž ití : Stanovení chlorid ů, ale v ě tšinou se neu ž ívá, vy ž aduje separátní zpracování vzorku (na Cl - se používá spíše fotometrické stanovení)  Konduktometrie – zalo ž ená na m ěř ení vodivosti analyzovaného roztoku, m ěř í se vodivost mezi dv ě ma platinovými elektrodami - elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku - pou ž ití : pro stanovení mo č oviny a hematokritu a zejména pro sledování čistoty destilované vody

14 Elektroforetické metody :  Zónová elektroforeza – zalo ž ena na rozdílu pohyblivosti č ástic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul a vlastnostech prost ř edí - jako nosi č se vyu ž ívá acetylcelulóza nebo r ů zné gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový) - d ě lení na acetylcelulózových, agarových a agarózových fóliích – dochází k distribuci podle velikosti náboje; po ukon č ení d ě lení se jednotlivé slo ž ky fixují a barví; pak se fólie odbarví, pop ř. zpr ů svitní a vysuší - d ě lení na polyakrylamidovém gelu – látky se d ě lí nejen podle elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul; efekt molekulového síta – polyakrylamidový gel s gradientem hustoty, p ř idá se laurylsíran sodný (SDS) a všechny molekuly mají tém ěř stejný náboj a d ě lí se jen podle velikosti - vyhodnocení – provádí se na denzitometru – elektroforeogram se automaticky posunuje nad št ě rbinou, kterou prochází sv ě tlo zvolené vlnové délky; v míst ě frakcí dochází k č áste č né absorpci zá ř ení; to se projeví p ř i jeho dopadu na č idlo a p ř evodu signálu na analogový záznam; po zpracování integrátorem získáme č íselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí - pou ž ití : ke stanovení frakcí bílkovin, lipoprotein ů, glykoprotein ů a jednotlivých izoenzym ů

15 Fyzikální metody :  Osmometrie – měření osmolality v séru a mo č i - osmotický tlak – tlak rozpušt ě ných, zejména nízkomolekulárních látek a iont ů v roztoku odd ě leném polopropustnou membránou od samotného rozpoušt ě dla - p ř ímo úm ě rný celkovému po č tu rozpušt ě ných nebo disociovaných č ástic - pokud látka disociuje každá disociovaná část je osmoticky aktivní částicí - nedisociovaná látka - jen jedna osmoticky aktivní částice - osmolalita (mmol/kg)– látková koncentrace osmoticky aktivních č ástic v 1 kg rozpoušt ě dla - orienta č ní výpo č et osmolality : osmolalita = 2 [Na + ]+[mo č ovina]+[glukóza]

16 Fyzikální metody - pokračování :  Onkometrie  onkotický tlak - koloidně osmotický tlak plazmatických bílkovin  v kPa  onkometry v KB - použití vzácně, většinou součástí přístrojové výbavy jednotek intenzivní péče a ARO

17 Chromatografické metody :  Chromatografie na tenkých vrstvách – vyu ž ívá se principu rozd ě lovací, adsorp č ní, ionexové i afinitní chromatografie - vzorky se nanášejí pipetou na hliníkovou fólii s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým a vyvíjí se v chromatografické komo ř e v soustav ě rozpoušt ě del –v klinické biochemii se používá méně než v minulosti a dává se přednost exaktnějším metodám  Plynová chromatografie – mobilní fáze je plynná a také separované slo ž ky jsou v plynném stavu - stacionární fáze m ůž e být tuhá látka (separace na principu adsorpce nebo sítového efektu) nebo kapalina zakotvená na nosi č i (rozd ě luje se slo ž ka mezi kapalnou stacionární a plynnou mobilní fázi) - stacionární fáze v obou p ř ípadech p ů sobí selektivn ě na jednotlivé separované látky a na základ ě vzájemných interakcí dochází k rozd ě lení (retenci, zadr ž ování) jednotlivých slo ž ek v kolon ě k jejich rozdílné eluci - rozd ě lené slo ž ky jsou unášeny nosným plynem z kolony a jejich mno ž ství je zaznamenáváno detektorem

18 Chromatografické metody - pokračování :  Kapalinová chromatografie – mobilní fáze je kapalná –v chromatografických kolonách –látky se dělí ve dvoufázovém dělícím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta

19 Metody imunochemické :  zalo ž eny na principu reakce antigen – protilátka  Protilátka se vá ž e na antigen biospecifickou vazbou  Antigen – vysokomolekulární látka, která je schopná vyvolat v ž ivém organismu imunitní odpov ěď, namí ř enou specificky proti pou ž itému antigenu - bílkoviny, glykoproteiny, polysacharidy a lipopolysacharidy, nukleotidy  Protilátky (imunoglobuliny) – bílkoviny, vykazující specifickou vazebnou aktivitu v ůč i antigenu, na jeho ž podn ě t se v organismu vytvo ř ily - jejich úkol – chránit organismus proti infekci - glykoproteiny

20 Metody vyšetřování nukleových kyselin :  zalo ž eny na studiu DNA (resp. RNA)  Metoda PCR – polymerázová řetězová reakce – pomocí ní m ěř íme n ě kolik kopií n ě které DNA sekvence lidského genomu amplifikací pomnožení, mnohonásobné kopírování - proces, kdy z n ě kolika málo kopií jedné molekuly (sekvence nukleotid ů ) získáme milion- i vícenásobek

21  kvalitativní - drogy, těhotenské testy princip sendvičové analýzy  kvantitativní  semikvantitativní – vypovídá už také o množství hledané látky - hodnocení - pomocí arbitrálních jednotek (0, 1, 2, 3, 4) - hodnocení na kříže - interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace - obvykle subjektivní vizuální hodnocení - nejčastěji proužky, zkumavky, jamky mikrotitračních destiček, plotny pro tenkovrstevnou chromatografii, jednoúčelné zkumavky, sklíčka … - detekce - oko, mikroskop, reflexní fotometrie, infračervená spektrofotometrie, kapilární elektroforéza atd. Metody :

22 Jednotky v klinické biochemii : Mezinárodní soustava jednotek SI – p ř ijata v roce 1977 Pou ž ití jednotek: v ě tšina analyt ů – v látkové koncentraci (mmol/l, mikromol/l,nmol/l) všechny bílkoviny – v hmotnostní koncentraci (g/l, mg/l) hemoglobin – v hmotnostní koncentraci (g/l) enzymová aktivita – mikrokat/l, nkat/l parciální tlaky pO 2 a pCO 2 – kPa

23 Rozdělení vyšetřovacích metod  „Mokrá chemie“ – reakce dvou roztoků  „Suchá chemie“ – reakce na tzv. stripu

24 „Mokrá chemie“

25

26 „Suchá chemie“

27  kolorimetrie rozdělovací vrstva reakční vrstva semipermeabilní membrána detekční vrstva nosná vrstva

28  potenciometrie iontově-selektivní membrána referenční vrstva elektroda Ag/AgCl

29  imunologie rozdělovací vrstva reakční vrstva gelová vrstva nosná vrstva

30 SOP

31 Metody stanovení glukozy 1. MS s izotopovým zřeďováním 2. Hexokinásová metoda (referenční metoda) 3. Glukosaoxidasová metoda 4. Glukosadehydrogenasová metoda 5. Elektrochemické metody

32 1. MS s izotopovým zřeďováním 1. ke vzorku se přidá známé množství glukozy, značené uhlíkem 14 C 2. složitým způsobem se provede derivatizace glukozy 3. těkavý derivát se separuje plynovou chromatografií 4. hmotnostní spektrometrií se určí poměr glukozy 12 C a 14 C 5. z poměru izotopů a známého přídavku lze určit koncentraci glukozy ve vzorku  vyžaduje speciální vybavení  trvá 2 dny  nejblíže se dělá v Německu

33 2. Hexokinázová metoda 1. katalýzy hexokinásou : fosfátová skupina z ATP se váže na glukozy 2. katalýza glukosa-6-fosfátdehydrogenasou : oxidace glukosa-6-fosfátu na 6- fosfoglukonát - oxidační činidlo NADP + se přitom redukuje na NADPH 2 růst absorbance při 340 nm referenční metoda vysoká specifita reakce stanovení ruší hemolýza a léčiva absorbující v UV

34 3. Glukosaoxidasová metoda 1. ß-D-glukosa je oxidována FAD na 5-glukonolakton za katalýzy glukosaoxidasou 2. redukovaná forma FADH 2 se vzdušným kyslíkem samovolně oxiduje zpět na FAD a O 2 se redukuje na H 2 O 2 3. vznikající 5-glukonolakton samovolně hydrolyzuje na kyselinu glukonovou 4. Trinderova reakce – POD katalyzuje oxidaci různých chromogenních akceptorů peroxidem vodíku zbarvení obvykle červené nejpoužívanější reakce v českých zemích

35 4. Trinderova reakce

36 4. Glukosadehydrogenasová metoda glukoza se může oxidovat na 5-glukonolakton také pomocí NAD + za katalýzy glukosadehydrogenasou oxidační činidlo se redukuje na NADH 2 odpovídající přírůstek absorbance se sleduje při 340 nm v česku se nevyužívá, v USA ano

37 5. Elektrochemické metody  úbytek O 2 při oxidaci glukosy v přítomnosti GOD a katalasy lze sledovat polarograficky Clarkovou kyslíkovou elektrodou (analyzátory Beckman)  využití enzymové elektrody s imobilizovanou GOD na elektrodové membráně (analyzátory Eppendorf)

38 Vztah mezi koncentrací/aktivitou a signálem  Koncentrace – vyjad ř uje se v hmotnostních nebo objemových jednotkách  Aktivita – definovaný ú č inek za definovaných podmínek  Matematický vztah – jednozna č ný a za definovaných podmínek stejný analysa je mo ž ná – u ž ití standard ů a kontrol

39 Kalibrace a kontroly  Kalibrace – standardy op ř ené o referen č ní metody stanovení obsahu  Kontroly – analysované referen č ními metodami nebo standardisovanými metodami na více pracovištích  Kalibrace a kontroly – stejné chování jako m ěř ené vzorky

40 Statistika v analýze :  Pr ů m ě r  Rozptyl  Standartní sm ě rodatná odchylka  Chyby m ěř ení : - hrubé - vznikají selhání pracovníka nebo přístroje nebo použitím nevhodné metody analýzy - vznikají obvykle jednorázově v důsledku vyjímečné příčiny - systematické - soustavné, s konkrétní předvídatelnou příčinou - stálý charakter, známá příčina - náhodné - zcela nepravidelně, v důsledku působení náhodných vlivů - ovlivňují přesnost výsledku  Správnost  P ř esnost  Systém kontroly kvality (vnit ř ní a vn ě jší) – další seminá ř

41 Přesnost  Míra shody mezi výsledky získanými opakovanou analýzou tého ž vzorku za p ř edem stanovených podmínek  Po č et stanovení – min. 20  Podle podmínek stanovení se d ě lí : - p. v sérii (opakovatelnost) - p. v č ase (reprodukovatelnost) - p. mezilaboratorní  Absolutní přesnost nelze nikdy docílit, náhodné chyby způsobují, že jsou výsledky rovnoměrně rozptýleny kolem průměrné hodnoty, přičemž četnost jednotlivých výsledků vykazuje normální rozložení (Gaussova křivka)

42 Matematicky  Vyjad ř ujeme nep ř esnost  Míra rozptylu nep ř esnosti – sm ě rodatná odchylka : ‡”( x i – x ) 2 x i – výsledky jednotlivých měření s = x – aritmetický průměr n - 1 n – počet měření Proto ž e velikost sm ě rodatné odchylky závisí na m ěř ené hodnot ě – po č ítá se tzv. relativní sm ě rodatná odchylka (varia č ní koeficient) : s VC = (. 100) x

43 Správnost  Shoda mezi výsledkem m ěř ení a skute č nou hodnotou  Vlastnost laboratorního m ěř ení vykázat/nevykázat chybu menší ne ž po ž adovanou  Funkcí náhodné a systematické chyby m ěř ení  Srovnává se o č ekávaná hodnota (x o ) s aritmetickým pr ů m ě rem opakovaných m ěř ení kontrolního vzorku ( x ) eliminována náhodná chyba m ěř ení

44 Nesprávnost  Zp ů sobena systematickou chybou p ř i analýze  Odchyluje výsledky v ž dy jedním sm ě rem  Matematicky : - chyba absolutní, bias, vychýlení : ( x – x 0 ) - chyba relativní (vzta ž ena ke správné hodnot ě ) : x – x o. 100 (%) x o

45 Vývoj v analytické chemii  Eliminace vlivu ru č ní práce na výsledek m ěř ení  Programové automaty s vyu ž itím PC  Metody standardisované, referen č ní  Standardy op ř ené o referen č ní materiály/metody  Kontrolní laboratorní systém se opírá o vhodné kontrolní materiály (fy Bio-Rad, SEKK, Instand)  Dokumentace metod - SOP

46 Výstup výsledků :  - p ř epis ze sešitu do LIS  - p ř enos on-line z p ř ístroj ů do LIS  Kontrola a editace výsledk ů LIS, NIS  Dynamické sledování výsledk ů  Papírová dokumentace – pro léka ř e - pro laborato ř – hlavní kniha, pracovní listy a sešity, výtisky archivace dat

47 POCT  point of care testing – analysa u l ůž ka pacienta  Po ž adavky : - rychlost stanovení - snadná obsluha - shoda výsledk ů s akceptovanými č i standardisovanými metodami - nízká cena - snadná dosa ž itelnost vzorku (malý objem krve)  Pou ž ití : - ARO + opera č ní sály - záchranná slu ž ba - laboratorní kout - praktický léka ř - vyšet ř ování v domácnosti

48 Děkuji za pozornost !


Stáhnout ppt "Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Č echák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV."

Podobné prezentace


Reklamy Google