Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje? Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje? Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i."— Transkript prezentace:

1 Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje? Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.

2 Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerů ve farmacii a polymerních léčiv Polymerní léčiva - konjugáty polymerů a nízkomolekulárních léčiv, polymerní kancerostatika Využití poznatků při dalších aplikacích - vektory pro genové terapie, diagnostika Závěr a výhledy

3 Co může zlepšit použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem? Klasické nízkomolekulární léčivo Konc čas [ hod] 048 dny - rok protrahovaný účinek řízené uvolňování Polymerní formy léčiv řízené uvolňovánícílený transport Opakované dávkování v relativně krátkých časových intervalech, vedlejší a často toxické účinky, v řadě případů malá účinnost léčby Potřeba jedné nebo jen několika dávek, malá spotřeba léčiva, minimalizace vedlejších účinků, účinnější léčba

4 Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“ – první představa o cílně působícím léčivu Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva Jindřich Kopeček: 1978 – model polymerních konjugátů s řízeným uvolněním léčiva Helmut Ringsdorf Jindrich Kopecek

5 Požadavky na „ideální“ léčivo  Léková forma, ve které je léčivo neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami)  v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka)  aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci  působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku  léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

6 Syntéza „knihoven“ látek o různé struktuře a pomocí screeningových metod provést výběr Pochopení vztahu mezi strukturou a vlastnostmi polymerních systémů použít pro návrhy struktur „na míru“ připravovaných polymerních léčiv Návrh struktur vyhovujících postulovaným požadavkům

7 Schéma klasického polymerního léčiva Léčivo (model) Biodegradovatelná spojka (oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

8 Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur) Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací CO NH CH 2 NH NH2H2 5 b CH 2 C CH 3 CO x CH 2 C CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH N S S SH NH 2 R-C=O

9 Polymerní léčivo Protilátkou směrované polymerní léčivo - hřeben Protilátkou směrované polymerní léčivo - hvězdice Polymerní léčivo – roubovaná struktura Polymerní micelární léčivo Polymerní léčivo s kombinovaným účinkem Polymerem modifikovaný virus pro genovou terapii Polymerní léčivo s kombinovaným účinkem – dvě léčiva Reaktivní prekurzor

10 Fyzikální a chemická struktura syntetických polymerů Lineární a větvená struktura Roubovaná struktura polymerní síť hvězdicová struktura Kopolymery a terpolymery Polymer – řetězec molekul (monomerů ) složený do makromolekuly

11 Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy

12 Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče Cévy (a) (b) (c) a)Uvolnění v krevním řečišti b)Uvolnění ve tkáni po extravazaci c)Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose

13 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu - chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

14 Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (PK1) (enzymatická aktivace léčiva) Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení O HO CH 3 OH OH OCH 3 O O HO CCH 2 HO O O NH a x CH 2 C CH 3 CH 2 C CH 3 CCOO NH CH 2 CH CH 3 OH

15 Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (pH závislá hydrolytická aktivace léčiva) Jednoduchá vazba nebo spacerMísto hydrolytického štěpení

16 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

17 Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče uvnitř cílové buňky S1S1 S3S3 S4S4 S2S2 S3´S3´ S1´S1´ S2´S2´ Gly-Phe-Leu-Gly--- Aktivní místo enzymu (proteázy) DOX Substrát (oligopeptid) Polymer Model léčiva, léčivo (DOX) Spojka (oligopeptid) ENZYM

18 Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů STRUKTURA% UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU 3 h6 h24 h -GFLG GLFG GG

19 pH 5.5 pH 7.4 Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH modelující prostředí v krvi (7.4) a uvnitř buněk (5.5)

20 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

21 Princip pasivního směrování – akumulace polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Normální tkáň Nádorová tkáň Fungující lymfatický systém Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

22 Biodistribuce poly(HPMA) nosiče (M w 60 kDa) v kryse s prostatickým AT1 nádorem, závislost na čase. Biodistribuce poly(HPMA) nosiče v myši s B16F10 melanomem. Vliv M w na distribuci.

23 Konjugáty umožňující pasivní směrování do pevných nádorů Nedegradovatelné polymerní léčivo (limit M w ~ g/mol) Biodegradovatelné vysokomolekulární roubované polymerní léčivo Micelární polymerní léčivo Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní léčivo dendritické struktury

24 Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu (s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX) M w (pol) = 32 kDa I = 1.8 M w (mic) = 170 kDa [DOX] = 7 wt% [cholesteryl] = 3.5 %mol d mic = 22 nm Vodné prostředí

25 + + Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací

26 Jednoduché dendritické jádro Semitelechelický HPMA kopolymer Hypervětvená polymerní léčiva na bázi dendrimeru G1 G2 + PAMAM dendrimery DOX M w ~ I n ~1.8 to 2.3 R h ~ nm M w ~ I n ~2.0 to 2.6 R h ~ nm

27 Uvolnění Dox z micelárního a roubovaného nosiče na bázi HPMA kopolymeru, fosfátový pufr o pH 5 (nebo pH 5,5) a 7.4, 37 °C pH 5 pH 7.4 pH 5.5

28 Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Akumulace v nádoru Eliminace z oběhu Akumulace modelu léčiva DY-676 na lineárním (Mw 30 KDa) a HMW hvězdicovém polymerním nosiči sledované u nu-nu myši (HT-29 colon carcinoma) 49 h po injekci (konfokální laserová fluorescenční mikroskopie)

29 Aktivní směrování – internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech Jádro primární endosom pH sekundární lysosom, pH 5, enzymy lysosom

30 Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) O HO CH 3 OH OH OCH 3 O O HO CCH 2 HO O O NH Oligopeptid -GlyPheLeuGly- 150 kDa

31 DOX S-CH 2 CH 2 -CO TT Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) X

32 Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp scFv-BTX: připravený metodami genového inženýrství (University of Oxford) BTX scFv BTX scFv BTX scFv Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp scF v H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH 30 kDa scFv: anti-PSMA, M 75 Ab (karb. anhydráza),

33 Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp scFv-BTX: připravený metodami genového inženýrství (University of Oxford) BTX scFv BTX scFv BTX scFv H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH

34 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Odstranění nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

35 Schéma degradace roubovaného konjugátu (degradace v reduktivním prostředí buňky) Degradace v cílové buňce Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

36 Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = mol/l Vylučovací mez polymeru ledvinami

37 Degradace polymerního dendritického léčiva v pufru modelujícím prostředí uvnitř buňky Reduktivní degradace c(glutathionu) = mol/l aqueous GPC, detection LS (Wyatt tech.) and RI column: Superose 6 TM, mobil phase: acetate buffer pH 6.5 DLS measurement PBS pH 5.5 Velikost klubka ve fosfátovém pufru s NaCl (DLS)

38 Protinádorová aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) Výsledky testů prováděných na MBÚ AV ČR. (a) In vitro testy (b) In vivo testy : terapeutický režim aplikace léčiva in vivo ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)

39 Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.), terapeutický režim podání a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)

40 Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x10 5, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den (terapeutický režim podání)

41 Ptotilátkami směrované polymerní konjugáty kancerostatik Výhody: vysoká účinnost léčby, jsou účinné i při nízkých koncentracích Nevýhody: jsou velmi specifické, není snadná příprava ve větším množství a je drahá, nepůsobí obecně na více typů onemocnění

42 Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát - terapeutický režim podání Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, pH závislá rychlost štěpení

43 Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita 10 5 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v., jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg A – konjugát s enzymatickou degradací B – konjugát s reduktivní degradací

44 Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva

45 Léčba dendritickým a roubovaným léčivem, EL4 T- buněčný lymfom, léčba 9 den po inokulaci Dávka 15 mg DOX eq./kg Polymerní konjugát (M w ≈ , I n = 1.9, DOX = 10.2 wt.%) Dávka 10 mg DOX eq./kg

46 Konjugáty PHPMA-DOX směrované scFv fragmentem anti-PSMA protilátky. Vazba DOX přes GFLG oligopeptid, scFv fragment anti-PSMA protilátky. Nádor prostaty PC346C v athymických myších. Dávka 2 x 0.05 mg DOXekv/kg. BTX scFv R. Willemsen, Erasmus Centre, Rotterdam

47 Maximální tolerovaná dávka léčiva PHPMA-DOX v myších

48 Přežití B/6 myší vyléčených od EL-4 lymfomu a retransplantovaných novou smrtelnou dávkou nádorových buněk EL 4 lymfomu (10 5 ) Micelární konjugáty lišící se strukturou hydrofobního jádra Hvězdicové konjugáty lišící se strukturou degradovatelné spojky (enzymaticky či reduktivně štěpitelné)

49 Využití poznatků z vývoje rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice a genové terapii

50 Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí Hmotová spektroskopie: (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: 0.5 M (78 mg/ml Gd) Komplex je stabilní (neuvolňuje Gd) minimálně po dobu 2 měsíců inkubace CH 2 C CH 3 CO CH 2 NH CH 2 HC CH 3 OH C CH 3 CO NH CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CO NH HC CO CH 2 CO NH NH HC CHCOOH CH 2 CH 2 COOH COOH COOH Gd MW: 24.8 kDa M w /M n : 1.92

51 * MR-Angiografie u krysy, porovnání komplexu poly(HPMA)-Gd s Gd-DTPA, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg poly(HPMA)-GdMagnevist firmy Schering Krebsforschunginstitut Heidelberg

52 MRI zobrazení krysy, pohled z břišní strany, různá hloubka zobrazení Univerzita Olomouc

53 Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

54 Genová terapie moderní léčebná technika založená na dopravě DNA nebo specifického genu do cílové buňky pacienta za účelem opravy či náhrady poškozeného genu, inhibice replikace genu a nebo vyvolání geneticky podmíněného zániku celé buňkyGen specifická část molekuly DNA (určená přesným pořadím nukleotidů) schopná replikace, která nese samostatnou jednotku genetické informace Vektor genové informace přenašeč genetické informace schopný dopravit gen do cílové buňky, nebo až do buněčného jádra (vektory jsou nevirální syntetické a nebo virální, adenoviry a retroviry).

55 Požadavky na vektory pro dopravu genu účinné v in vivo podmínkách 1.Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému 2.Extravazace do cílové tkáně 3.Interakce s receptory cílových buněk 4.Endocytoza 5.Únik z endosomu do cytoplasmy 6.Transport k buněčnému jádru 7.Účinná transfekce, transdukce a produkce aktivního proteinu

56 Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Rekombinantní adenovir: potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy

57 Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem + + Semitelechelický monovalentní polymer Aminoskupina Reaktivní esterová skupina PEK, Virus Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus Rekombinantní adenovirus nesoucí specifický gen

58 pH < 6 GSH Buněčná membrána Směrující struktura endosom Extracelární prostředí Ochranný polymer adenovirová kapsida Degradovatelné vazby Prostředí v buňce Přesměrovaný virus Uvolnění DNA Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce

59 Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu CH 2 C CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH CH 2 C CH 3 CO O (CH 2 ) 2 NCH 3 CH 3 CH 3 CH 2 C CH 3 CO NH (CH 2 ) 2 CO N S S (CH 2 ) 2 NH CO (CH 2 ) 2 S S CH 2 C CH 3 CO NH (CH 2 ) 2 CO (CH 2 ) 2 NH CO (CH 2 ) 2 S S Cl EGF Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě)

60 Modifikace virů kopolymerem HPMA obsahujícím směrující skupinu Nemodifikovaný virusPolymerem modifikovaný virus

61 Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor), připojením směrující struktury se aktivita specificky obnoví Transgenní exprese genu Ad5-GFP Polymerem modifikovaný virus Asociace s buňkami (FACS) Virus retargetovaný pomocí bFGF

62 SKOV3 Ovariální nádor Buňky Virus PHPMA modi- fikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem

63 Směrování adenovirů jako vektorů genové informace pomocí scFv specifických protilátek scFv H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH Ad-PHPMA-BTXbp BTX scFv BTX scFv BTX scFv

64 ZÁVĚRY. Vodorozpustné polymerní nosiče léčiv na bázi kopolymerů HPMA představují významnou alternativu při vývoji pasivně i aktivně směrovaných kancerostatik. Polymerní cytostatika mají minimální vedlejší účinky, nepoškozují imunitní systém jako klasická cytostatika a vykazují, na rozdíl od klasické chemoterapie, kromě výrazně zlepšeného chemoterapeutického efektu i efekt imunostimulační. Tento efekt se uplatňuje u různých typů nádorů (u myší i u lidských pacientů). Polymerní nosičové systémy mají širokou škálu použití i v jiných oblastech medicíny, např. v diagnostice (MR zobrazení) a při vývoji systémů pro genovou terapii.

65 Poděkování spolupracovníkům Týmu pracovníků oddělení biolékařských polymerů ÚMCH AV ČR Týmu Prof. Blanky Říhové, MBÚ AV ČR Týmu Prof. Lena Seymoura, University of Oxford, UK Kolegům na University of Halle (Prof. K. Mader) Akademii věd ČR za finanční podporu výzkumu (Akademická prémie)


Stáhnout ppt "Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje? Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i."

Podobné prezentace


Reklamy Google