Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba. Využití MS - kvalitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Využití MS - kvantitativní analýza.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba. Využití MS - kvalitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Využití MS - kvantitativní analýza."— Transkript prezentace:

1 Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba

2 Využití MS - kvalitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Využití MS - kvantitativní analýza Electron Impact ionizace (EI + 70 eV) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty Speciální aplikace MS Úprava vzorků pro MS analýzy SPE, SPME, extrakce ……. ICP-MS, Isotope Ratio MS

3 Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (70 eV) Neutrální molekula – sudý počet elektronů Molekulový ion – lichý počet počet elektronů Ionizační energie (IE) – energie nutná k odtržení elektronu z molekuly

4 Molekulový ion  informace o hmotnosti popř. chemickém složení látky, ion s lichým počtem elektronů, jeho m/z nejvyšší v MS spektru (mimo ionty izotopických příspěvků a pozadí); v MS spektru existují také nižší fragmenty s m/z molekulového iontu zmenšenou o logickou ztrátu neutrálních molekul a fragmentů Povolené ztráty m/z 15  CH  H 2 O 28  C 2 H 4 nebo CO 35  Cl 36  HCl Zakázané ztráty m/z , Podle intenzity izotopických fragmentů  lze poznat přítomnost Cl, Br, lze zjistit počet atomů uhlíku fragmentu Jsou-li přítomny tyto fragmenty v MS spektru, sledovaný ion určitě není molekulární. R+DB musí být celé číslo (R+DB = C -1/2 H + 1/2N +1) Elektronová ionizace (EI + 70 eV)

5 Fragmentace molekulového iontu a dalších vzniklých iontů Homolytické štěpení Heterolytické štěpení Přesmyky Elektronová ionizace (EI + 70 eV)

6 Fragmentace EI+ 70 eV 120 – 91 = 29 Ztráta neutrální částice (molekuly nebo radikálu) z rozdílů hmot píků se získají tzv. neutrální ztráty  vypovídají o struktuře molekuly Elektronová ionizace (EI + 70 eV)

7 Běžné neutrální ztráty EI+ (70 eV) ionizace

8 Série nízkých iontů (1) - EI+ (70 eV) ionizace

9 Série nízkých iontů (2) - EI+ (70 eV) ionizace

10 n-dekan C3H7+C3H7+ C4H9+C4H9+ C 5 H 11 + C 6 H 13 + inkrement CH 2 C 7 H 15 + C 8 H 17 + EI + 70 eV: MS spektra - alkany

11 EI+ 70 eV: MS spektra alkanů (2) n-alkaniso-alkan n-C 22 n-C 8 iso-C 8

12 EI+ 70 eV:MS spektra alkenů a cykloalkanů MS spektra alkenů jsou podobná cykloalkánům alken alkylcyklopentan alkylcyklohexan

13 EI+70 eV: MS spektra aromátů alkylsubstituované benzeny chudší fragmentace  stabilní arom. kruh, fragmenty z alkylu  nejintenzivnější píky  91 / 92 (tropilium) molekulový ion (toluen 92, xyleny 106, triMeBenzeny 120, atd.) benzen butylbenzen M + 78 M + 134

14 Benzo(a)pyren EI+ 70 eV: MS spektra polyaromátů M + = 252 M + /2 = 126 M + = 252 Benzo(b)fluoranthen geometrické izomery PAU prakticky nelze rozlišit pomocí MS intenzivní molekulový iont M + (m/z ; z=1) + 2x nabitý mol. iont (m/z ; z=2) POZOR !!! nejedná se o fragment!!!

15 EI+ 70 eV:MS spektra alkoholů 1-hexadecanol 1-hexadecen Alkoholy – podobná spektra jako alkeny, lze je rozlišit podle iontu m/z 31 (alkeny nemají), mají navíc velmi malý molekulový ion, nebo úplně chybí m/z 31

16 benzylalkohol fenyl + inkrement OH tropylium + inkrement CH 2 OH molekulový ion m/z 109 M+1  izotop 13 C EI+70 eV: MS spektrum - aromatický alkohol

17 EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - amíny Triethylamin Anilin

18 EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - nitrosloučeniny 2,4,6 - trinitrotoluen RDX plastická trhavina M = 222 Da

19 EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter National Institute of. NIST spekter Standards and Techn ( sloučenin) John Wiley & Sons Wiley Registry 8th Ed spekter Pallisade MS Pallisade Complete > spekter Oborové free-ware databáze Univerzální komerční databáze John Wiley & Sons Biomarkes 1110 spekter John Wiley & Sons Steroids 2979 spekter Oborové komerční databáze American Academy of Forensic Science (AAFS) “Comprehensive drug LIbrary “(http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm)http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm The Int. Association of Forensic Toxicologosts (TIAFT) “Derivatives of Drugs “(

20 PBM - Probability Based Matching (McLafferty & Stauffer) – rok 1976 Dot Product (Finnigan/INCOS) – rok 1978 Mass Spectral Tree Search (Mistrik) – od roku 2000 (pro MS/MS experimenty, LC/MS aplikace) Weighted Dot Product (Stein) – od r algoritmus součástí NIST SEARCH programu Forward search – porovnává všechny píky spektra, nejvíce podobná spektra přiřadí Reverse search – nebere v úvahu všechny píky měřeného spektra, píky, které se neshodují s přířazeným databázovým spektrem ignoruje Změřené MS spektrum je porovnáváno s databázovými spektry podle různých algoritmů EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter – počítačové vyhledávání

21 EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Výsledkem porovnání měřeného MS spektra s databázovými je několik spekter (HITů) - o kvalitě knihovního nálezu vypovídá tzv. MATCH factor (0-999) – vyšší hodnota – lepší shoda

22 Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale … EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter

23 Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter

24 GC/MS: pomoc při identifikaci n-C 17 n-C 18 n-C 16 n-C 15 n-C 14 Kovatsův retenční index (RI) RI = 100n + 100[log(t x ) − log(t n )] / [log(t n+1 ) − log(t n )] txtx tntn t n+1 Hodnoty RI jsou dostupné pro celou řadu látek a podmínek – fáze GC kolony (nepolární vs polární), teplotní program separace atd. NIST 05 MS knihovna n … počet atomů uhlíku n-alkánu před sloučeninou X t n … retenční čas n-alkánu před sloučeninou X t n+1 … retenční čas n-alkánu za sloučeninou X t x … retenční čas sloučeniny X log.. přirozený logaritmus

25 LC/MS: kvalitativní analýza Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim M + 23 (Na+) M + 39 (K+) M + 32 (CH3OH) M + 41 (CH3CN) M + 22 (Na+ -H) M + 45 (COOH-) M + 59 (CH3COO-) M + 58 (NaCl) M + 41 (CH3CN) M - 1 ( - H+) Negativní režim M + 1 (H+) Možné adukty

26 LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) – série iontů – nestejné rozdíly mezi m/z – příklad koňský myoglobin (M = Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2.. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-X)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 10.94, Mcalc = Da m1 = 1305, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.07, Mcalc = Da

27 LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty malé molekuly – příklad dvounásobně nabitý ion – poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy M = 2477,5292 Da [M+H]+ = 2478,5372 Da  0,5 Da  1 Da C156 H204 N8 O18 z = 2 z = 1 [M+H]+ [M+2H]2+

28 kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik APCI+ [M+H] +

29 kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik ESI+ [M+Na] +

30 kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik EI+ 70 eV

31 LC/MS/MS: kvalitativní analýza Lze měřit jen s IT, QqQ, nebo hybridními MS spektrometry (Q-TOF,IT-Orbitrap) 1.Separátor výběr iontu -> „definované rozbití” iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem APCI pos MS spektrum [M+H]+ MS 2 -MS/MS z [M+H]+ MS 3 - MS/MS z m/z 523

32 LC/MS/MS: kvalitativní analýza Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-TOF brochure C 24 H 27 NO 6 + Na m/z 448,1736 C 15 H 31 N 5 O 6 Cl 2 + H m/z 448,1730 Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R =

33 MS: Kvantitativní analýza 1.Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt 2.Zjištění jeho koncentrace ve vzorku CÍL: Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) – znám retenční čas (RT) EI+ 70 eV: TIC režim (menší citlivost) – pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) – vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) – MS/MS technika – 1 analyzátor SIM (výběr iontu) – 2. analyzátor kolize – 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy)

34 LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Zdroj: Agilent technologies App. Note Izotopicky označený standard – stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost – používá se jako vnitřní standard (Internal Standard – IS) Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard

35 Analyt (Plocha A) Vnitřní standard (Plocha Ais) c.. Koncentrace A/Ais c/cis A/Ais = RRF. c/cis RRF.. Relativní odezvový faktor Směrnice přímky je RRF MS: Kvantitativní analýza Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou Kalibrační přímka Kalibrace s použitím vnitřního standardu

36 MS: Kvantitativní analýza A/Ais c/cis Mez detekce (Limit of Detection - LOD) Mez stanovitelnosti (LOQ - Limit of Quantification) Signál (signal) Šum (noise) LOD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RRF LOQ ~ 10 x (Anoise/Ais) / RRF Kalibrační rozsah

37 MS: Kvantitativní analýza – citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky – udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny – zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = g) nebo femtogramů (fg = g) GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (OFN) – SIM režim m/z S/N > X LC/MS/MS: FIA: ESI+ 100 fg reserpine MRM: m/z 609 ->m/z 397 a 447 S/N > X C 33 H 40 N 2 O 9 C 10 F 8 Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (Full Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM (MRM) ng ;TIC (Full Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny – odezva MS detektoru není univerzální

38 Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) Purge and Trap SPME (Solid Phase Microextraction) Pro těkavé sloučeniny (VOC)

39 Předúprava vzorků: SPE – Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny

40 Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75  m/ Poludimethylsiloxan (PDMS) 85  m těkavé látky Mw 30 – 225 Da PDMS 100  m těkavé látky Mw 60 – 275 Da PDMS 30  m semitěkavé nepolární Polyakrylát (PA) 85  m semitěkavé polární Kompatibilita s vodnou matricí

41 Předúprava vzorků: Purge and Trap (P-T) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z vody Vzorek je vystripován z vody proudem plynu (dusík, He) a organické látky jsou sorbovány na sorbent Sorbent je desorbován, organické látky zakoncentrovány a přeneseny na GC kolonu

42 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů)

43 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace

44 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) ICP torch – tvorba iontů

45 ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie)

46 ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice Organická látka je katalyticky spálena na CO 2 (CuO/Pt~ 800°C), voda je odstraněna přes NAFION membránu a CO 2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 CO 2 m/z 45 a druhý na 12 CO 2 m/z 44) Standartní ref. látka – CaCO 3 Pee Dee Belemnite (PDB) – rozkladem CO 2 s poměrem p PDB = 13 C/ 12 C = 0,01123  13 C = 1000 * (p vzorek – p PDB )/p PDB Methan atmosféra Fosilní paliva PDB CO 2 atmosféra CO 2 výdech lidi USA CO 2 výdech lidi Evropa


Stáhnout ppt "Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba. Využití MS - kvalitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Využití MS - kvantitativní analýza."

Podobné prezentace


Reklamy Google