Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA

Prezentace na téma: "Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA"— Transkript prezentace:

1 Identifikace bakterií metodou broad-range PCR-HRMA
Lucie Navrátilová 2. ročník MBB PřF UP v Olomouci 2007/2008

2 určení diagnózy co nejdříve
medicína hledá rychlý, snadný a levný způsob identifikace bakterií

3 Bakterie nejjednodušší jednobuněčné organismy, viditelné pod mikroskopem patogenní X nepatogenní

4 DNA (deoxyribonukleová kyselina)
nosič genetické informace v podobě sekvencí nukleotidů podle rozdílností mezi geny se dají organismy identifikovat GEN = sekvence nukleotidů s biologickou funkcí

5 Identifikace určení izolovaného mikroba
souboru znaků mikroba porovnává se znaky identifikační maticí

6 Broad-range PCR-HRMA

7 PCR (Polymerase Chain Reaction)
biochemická reakce využívá DNA-polymerázy ke klonování DNA DENATURACE (94-96°C) NASEDÁNÍ PRIMERŮ (cca 53°C) EXTENZE (72°C)

8 HRMA (High-Resolution Melting Analysis)
identifikace bakterií na základě odlišností mezi tt jejich DNA Tm = melting temperature

9 Příklad zvolený gen leží v úseku 16S rDNA zkoumané druhy bakterií:
Burkholderia cepacia pickettii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia

10 Burkholderia cepacia

11 Pseudomonas aeruginosa

12 Stenotrophomonas maltophilia

13 PCR směs pro 1 reakci LCGreen 2 destilovaná voda 14,24 μl DNA pufr 2
dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

14 PCR směs pro 1 reakci LCGreen 2 destilovaná voda 14,24 μl DNA pufr 2
dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

15 PCR směs pro 1 reakci primer F 0,1 primer R 0,1
destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

16 PCR směs pro 1 reakci Taq-polymeráza 0,4 destilovaná voda 14,24 μl
LCGreen 2 DNA pufr 2 dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

17 PCR směs pro 1 reakci destilovaná voda 14,24 μl LCGreen 2 DNA pufr 2
dNTPs (0,2 mmol/l) 0,16 primer F 0,1 primer R 0,1 rozpipetujeme do předem označených mikrozkumavek po 18,6 μl templátovaná DNA (40 – 60 ng/μl) 0,1 μl Taq-polymeráza 0,4 do každé mikrozkumavky napipetujeme 20 μl PCR oleje

18 Obr.2: Aparatura pro PCR-HRMA
Obr.3: RotorGene

19 DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’
3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

20 Denaturace DNA 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’
3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

21 Nasedání primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

22 Extenze primerů 5’-GCAATCGCGATTAGGCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGG3’-CTAATATC-5’ 5’-GCGATTAG-3’ GCATTAGCTATTTATGTATGCCCGATTATAGAGCG-3’ 3’-CGTTAGCGCTAATCCGTAATCGATAAATACATACGGGCTAATATCTCGC-5’

23 Graf 1: Normalizovaný graf denaturované DNA
fluorescence - normalizovaná teplota °C

24 Graf 2: Normalizovaný graf denaturované DNA
fluorescence - normalizovaná teplota °C

25 Použitá literatura deSilva D., Blackett J.,High-Resolution melting & Unlabeled probes Developing a Simple and Inexpensive Genotyping Assay with Lunaprobes, Genetic Engineering & biotechnology News, 27, publish on-line: Votava M., Lékařská mikrobiologie - obecná, Neptun, 2005

26 Děkuji za pozornost!