Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009 ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009 ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České."— Transkript prezentace:

1 EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009 ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České Budějovice, Stromovka, leden 2003

2 EFŽ Environmentální fyziologie živočichů Vladimír Košťál, 2009 Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav

3 EFŽ Teplota teploty v biosféře se pohybují řádově v rozmezí od -80 do +80 °C životní procesy jsou podmíněny přítomností vody v kapalné fázi (teoreticky 0 až 100  C) teplota přímo ovlivňuje celou řadu biofyzikálních a biochemických struktur a procesů: - rozpustnost plynů ve vodě - iontovou disociaci molekul a pH - rychlost pohybu (energii) molekul - prostorovou konformaci molekul - tekutost a fázi biologických membrán - aktivitu enzymů -  rychlost metabolických drah, fyziologických procesů a životních projevů změny teploty zasahují velké množství "cílových" struktur a procesů zároveň struktury a procesy jsou "naladěny" na určitou optimální teplotu změny teploty v jednotlivých (mikro)-habitatech jsou: - běžné (ale ne všudypřítomné: abysál, litosféra, tropy) - habitatově specifické - často cyklické (denní, sezónní) organismy jsou adaptovány na teplotní proměnlivost jejich habitatů adaptované organismy jsou schopny absolvovat fenotypickou změnu  teplotní aklimaci (aklimatizaci)

4 EFŽ tvorba ledových krystalů pevná fáze vody je neslučitelná s aktivními životními procesy, dochází k zakoncentrování nezmrzlé části roztoku, dosažení až toxických koncentrací, objemové změny mohou překročit mechanické a elastické limity buněk změna optimální konformace proteinů až denaturace zpomalení procesů rozpad polymerů na podjednotky nízkoteplotní denaturace pod ca. -15°C vysokoteplotní denaturace nad ca. 45°C změny vlastností lipidů v biologických membránách narušení optimální "tekutosti" pro funkci integrovaných proteinů neregulované fázové přechody do gelové nebo hexagonální fáze jsou neslučitelné s funkcí membrány narušení elektrochemických potenciálů přes buněčné membrány a epiteliální tkáně desynchronizace metabolických funkcí "uncoupling", "disorder" nedostatek energie ve formě ATP zpomalení až ustávání základních procesů: transkripce DNA, syntézy a degradace proteinů, transportů, komunikace a přenosu signálů nekrotická nebo apoptotická buněčná smrt Poškozující účinky teplot mimo optimum

5 EFŽ Termální biologie bezobratlých převažuje poikilotermie a ektotermie relativní homeotermie je možná buď ve stabilním prostředí (moře) nebo díky behaviorální termoregulaci basking = slunění ukrývání – ochlazování velmi účinná strategie: endotermie připadá v úvahu za letu, který vyžaduje velmi rychlý oxidativní metabolismus a naopak je potřeba se efektivně zbavovat přebytečného tepla behaviorální termoregulace nymf P. apterus za letního dne larvy půda na slunci půda ve stínu

6 EFŽ přezimující larvy muchnic březnových (Bibio marci) tvoří kolonie (hnízda), larvy konzumují detrit a produkují exkrementy na nichž se živí bakterie a společně tak produkují teplo... Endotermie super-organismu při pojetí hnízda (kolonie) hmyzu jako super-organismu, můžeme také uvažovat endotermii: hnízdo marvenců Pogonomyrmex badius (Florida, USA) v hloubce půdy je relativně velmi stálá teplota přemísťováním plodu lze zajistit termoregulaci  optimální teplotu pro vývoj

7 EFŽ včelí úly snímané infračervenou kamerou Endotermie super-organismu hnízda termitů mají termoregulační systém chodeb vzdušných a kanálů který je vzorem futuristických staveb záznam teplot v hnízdě a okolí u dvou druhů včel Apis mellifera (nahoře) Trigona carbonaria (dole)

8 EFŽ jak se vyrovnat se zvýšením teploty prostředí ? behaviorální termoregulace evaporace (omezená u malých živočichů) kviescence diapauza vliv sorbitolu (tmavé sloupce) na relativní aktivitu dvou enzymů molice Bemisia argentifolii za různých teplot Supra-optimální (vysoké) teploty up-regulace šokových proteinů (HSPs) - indukčním faktorem jsou chybně složené proteiny nebo částečně denaturované proteiny biosyntéza termoprotektantů (dosud popsána pouze u molic a mšic) expozice ve vysokých, subletálních teplotách stimuluje akumulaci sorbitolu (myo-inositolu) polyoly chrání proteiny před denaturací teplem

9 EFŽ Lopez-Martinez & Denlinger (2008). Physiol. Entomol. 33, larvy vrtule jablečné (Rhagoletis pomonella) žijí ve dřeni jablek... max. letní denní maxima v některých mikro-habitatech dosahují supra-optimálních teplot: záznam teploty v průběhu dne - nahoře: vzduch - dole: dřeň jablka na slunci... a v době teplotního maxima syntetizují šokové proteiny Denní oscilace teplot

10 EFŽ Sub-optimální (nízké) teploty Rychlost procesu (vývoj, růst, pohyb...) Tělní teplota [°C] LTT 0°C0°C Oblast nízkých teplot začíná pro různé druhy hmyzu (a v různých situacích) na různých hodnotách teploty LTT: tropické druhy: ca °C neaklimované temperátní druhy: ca °C aklimované temperátní a polární druhy: až -0.6°C (m.p.) definice nízkých teplot minimum podchlazený stav m.p. optimum 20 – 30 °C maximum hypotermní stav kryotermní stav ULCIZ SCP, supercooling point reálná teplota krystalizace tělní vody m.p., melting point rovnovážná teplota tání a krystalizace tělní vody SCP (Lower Temperature Threshold) promrzlý stav

11 EFŽ zimní slunovrat: 21. prosince letní slunovrat: 21. června zkracování délky dne DIAPAUZA HIBERNACE AKTIVITA short day short night 50°N Příprava k přezimování začíná v létě krátký nebo zkracující se den po letním slunovratu je signálem příchodu zimy začíná příprava na zimu sezónní změna fenotypu

12 EFŽ Hmyz Savci suprachiasmatická jádra laterální neurony Časoměrné systémy sledují délku dne...

13 HmyzSavci EFŽ Biologické hodiny Časoměrné systémy sledují délku dne... biologické hodiny hmyzu a savců mají shodný princip a sdílejí i některé „hodinové geny“ produkty hodinových genů (proteiny) však mohou nabývat různých funkcí u různých druhů

14 EFŽ Hmyz Savci melatonin PDF juvenilní hormon ekdyson gonádotropiny prolaktin... a ovlivňují výdej důležitých hormonů "hormony léta" podzim - zima... transdukují fotoperiodický signál...

15 EFŽ hromadí energetické zásoby svišť Marmota marmota tuková kapénka granule glykogenu ploštice Pyrrhocoris apterus buňka tukového tělesa zlepšují izolační vrstvu mění srst mění chování shání potravu hledají/budují zimní doupata migrují do teplejších oblastí zastavují rozmnožování hromadí energetické zásoby zastavují rozmnožování zlepšují izolační vrstvu mění sílu a kvalitu voskové vrstvy mění chování shání potravu hledají/budují zimní úkryty (migrují do zimovišť) HmyzSavci Nedostatek „hormonů léta“ způsobí změnu fenotypu

16 EFŽ Fenotypická změna je komplexní... HmyzSavci je pozorovatelná jako hluboká sezónní změna transkriptómu a proteómu sysel Spermophilus lateralis proteiny up-regulované při vstupu do hibernace kukly masařky Sarcophage crassipalpis proteiny up-regulované při vstupu do diapauzy

17 EFŽ short days decreasing temperature perception gene expression hormonal milieu developmental mode behaviour energy reserves water balance ion homeostasis ice nucleators membranes antioxidants metabolism shock proteins protein activities transduction morphology antifreeze proteins reproducing cold-sensitive animal in summer diapausing cold-hardy animal in winter cryoprotectants Fenotypická změna je komplexní... defence systems

18 EFŽ jsou endotermní regulují svou tělesnou teplotu po celou zimu je ektotermní nedokáže účinně regulovat svou tělesnou teplotu během zimy nastavují "regulátor teploty" v hypotalamických neuronech na nižší, ale nad-nulovou hodnotu tělní teplota sleduje teplotu prostředí a ta často, někdy hluboko a dlouhodobě, klesá pod nulu SavciHmyz průběh tělních teplot u hibernujícího sviště typický záznam zimních teplot vzduchu a v listové hrabance pod lipami (České Budějovice) V čem je tedy rozdíl ?

19 EFŽ 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné (ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) ! Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot toto jsou dvě nejčastěji uváděné a porovnávané strategie

20 EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - subnivál strategie živočichů obývajících teplotně pufrované habitaty (půda) kolonie chvostokoků Ceratophysella sigillata migrující po sněhu v lednu (Švýcarsko, 600 m n.m.) během migrace se páří, živí se na nárůstech řas na odumřelém dřevě (v létě upadají do dormantního stavu)

21 EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - mediterán brouk z čeledi Catopidae (západní a střední Evropa), jehož larvální vývoj probíhá v zimě, imaga prodělávají aestivaci a kladou na podzim živí se saprofágně a nekro- fágně Boreus sp. (Mecoptera) Chionea sp. Triphleba sp. (Diptera) imaga srpice Boreus a více druhů much se páří na sněhu v zimě často jsou imaga bezkřídlá adaptivní výhodou přesunu aktivní fáze je patrně využití volné niky s nižším tlakem parazitů a predátorů a s dostatkem potravy někteří členovci přesunuli aktivní fázi svého životního cyklu (růst, vývoj, reprodukci) do chladného období roku letní podmínky mohou být nepříznivé zatímco zimní jsou relativně permisívní typicky v mediteránních habitatech - desikace - nedostatek potravy - biotický tlak)  zimní aktivita letní dormance, aestivace

22 EFŽ polární kruh = 66° j. nebo s.š. vymezení hranice tundry (a alpinní zóny) = izoterma 10°C nejteplejšího měsíce roku relativní porovnání aspektů polárního klimatu: ArktidaAntarktida drsnost nízké teploty a teplotní extrémy velkáještě větší sezónnost rozdíl mezi létem a zimou zřejmáméně zřejmá predikovatelnost dlouhodobá, sezónní dobráslabší krátkodobá, během léta slabámizivá zdroje potravy dostupnost, bohatost omezenévelmi omezené navzdory drsnosti klimatických podmínek a omezenosti zdrojů je druhová diverzita členovců (hmyzu !) za severním polárním kruhem poměrně velká Arktida má mnohem větší druhové bohatství díky spojení s pevninou příklad: za hranicí růstu stromů žije jen v Severní Americe na 2200 druhů hmyzu ! Extrémní – polární habitaty

23 EFŽ Extrémní – polární habitaty vymezeny zhruba polárními kruhy (66  s.š. nebo j.š.) přesněji izotermou 10  C nejteplejšího měsíce (přibližně hranice růstu stromů) ostrov Jamese Rosse Česká antarktická základna

24 EFŽ housenka můry Pringleophaga marioni je klíčovým dekompozitorem (největším herbivorem) sub-antarktického ostrova Marion island (JAR) housenky se vyvíjejí několik let imaga jsou brachypterní housenky tolerují mírné promrznutí SCP je kolem -5°C spodní limit přežívání je necelých -6 °C Stálá aktivita za nízkých teplot – sub-polární habitaty v sub-Antarktických suchozemských habitatech je stálá nízká teplota - teploty kolem 0  C - větrno - vysoká vlhkost (časté srážky) obrázek ukazuje: b = prudký pokles metabolismu při teplotě -0.6 °C, který není způsoben mrznutím ale odpovídá vstupu do "chill coma" stavu Tc = peak CO 2, který přesně koresponduje s teplotou krystalizace (zvětšení objemu vody při mrznutí  stlačení  vypuzení CO 2 ) střední část = nenulový metabolismus v promrzlém stavu konec = okamžité obnovení metabolismu po vzestupu teploty travnatý Marion Island [  C] [uL CO 2 / h / mg]

25 EFŽ Adaptace na život za polárními kruhy Výběr mikrohabitu pufrované habitaty pro aktivitu a "letní" ukrývání: půda, travní trsy, ptačí guáno osluněná místa pro "basking„ zimní úkryty – pufrované (pod sněhem) – exponované – překvapivě často je volen exponovaný zimní úkryt s nízkou vrstvou sněhu  zdá se, že krátkost letního období je v mnoha případech větší evoluční překažkou než extrémnost zimních teplot bezkřídlá moucha Anatalanta aptera žije v ptačím guánu na sub-Antarktických ostrovech Morfologická přizpůsobení malá velikost melanismus hirsutismus apterygie

26 EFŽ bezkřídlá moucha Belgica antarctica žije v guánu kolonií tučňáků larvy se vyvíjí dva roky, imago žije jen několik dnů délka 2-6 mm  největší suchozemský živočich pevninské Antarktidy Antarktický bestiář Rick Lee & Dave Denlinger chvostoskok Cryptopygus antarcticus žije 3 roky roztoč Alaskozetes antarcticus se vyvíjí pod kameny 5 – 7 let parazitické klíště Ixodes uriae saje krev ptáků na obou pólech může hladovět až 11 měsíců, pak tvoří shluky pod kameny v ptačích koloniích

27 EFŽ fotoperiodický signál je v polárních zónách silně ovlivněn polárním létem/zimou, členovci žijí v pufrovaných mikrohabitatech (půda, vegetační kryt, subnivál)  sezónní průběh teploty bývá hlavním ignálem pro načasování životního cyklu polární léto je krátké a chladné a pouze omezená suma energie je dostupná pro dokončení celého vývojového cyklu  strategie max. urychlení vývoje  strategie rozdělení vývoje do ročních fází oddělených přezimováním redukce adultního stádia většinu životního cyklu zabírají nedospělá stádia a stádium imaga bývá velmi efemérní až redukované arktické muchničky (Simulidae) dospělé samičky mají redukované ústní ústrojí vajíčka se vyvíjejí již u farátních imag z larválních zásob častá pathenogeneze Prosimulium ursinum = extrémní případ: dospělá samička se vůbec nelíhne z kukelní schránky, nýbrž umírá a po rozpadu schránky se vajíčka uvolňují do potoků, kde se z nich líhnou partenogenetické larvy příští jaro... partenogeneze eliminace nutnosti páření a celého sexuálního chování (vyhledávání partnera) stabilita genomu, který se "osvědčil" v danných podmínkách Polární adaptace životního cyklu Strategie urychleného vývoje akcelerace letního vývoje skupiny charakteristické krátkým vývojem (malé mouchy, mšice) jsou početně zastoupeny u mšic jsou většinou eliminovány letní parteno- genetické generace vivipar a fundatrix rovnou produkují sexuální morfy, které kladou přezimu- jící vajíčka mono-voltinnost zajišťuje, že přezimování je vystaveno vždy stejné, rezistentní vývojové stádium (vajíčko, kukla) imago muchničky Prosimulium sp.

28 EFŽ Polární adaptace životního cyklu Strategie víceletých životních cyklů velmi častá strategie různých taxonů (roztoči, pavouci, chvostoskoci, hmyz) 2 – 7 leté cykly jsou obvyklé, přezimování je možné ve více (nebo všech) stádiích můra Gynaephora groenlandica arktická můra Gynaephora groenlandica (Grónsko) má až 14 letý cyklus housenky se živí listy arktické zakrslé vrby Salix arctica v létě tráví 60 % času "baskingem" (v noci) a zbytek žírem (v poledne) tolerují zmrznutí i v létě v létě jsou 2/3 populace parazitovány (Hyposoter, Exorista) přezimování housenek: již po slunovratu nastupuje diapauza, migrace do půdy  hypotermie důvody: aktivita parazitů pokles kvality potravy příprava na zimu příprava na zimu: akumulace glycerolu a trehalózy degradace mitochondrií (2 měs.) jarní rekonstituce mitochondrií trvá asi 2 týdny

29 EFŽ 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné (ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) ! Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot toto jsou dvě nejčastěji uváděné a porovnávané strategie

30 EFŽ každá molekula vody v ledu tvoří vodíkové můstky se čtyřmi sousedními molekulami (tetrahedrální vazba) a zakládá tak velmi charakteristickou hexagonální strukturu ledových krystalů Bod tání (rovnovážný bod mrznutí) fázové chování vody ve vodných roztocích tělních tekutin: - hemolymfa - obsah střeva (a jiných lumenů) - intracelulární roztoky Teplota krystalizace (reálný bod mrznutí) homogení nukleace heterogení nukleace krystalizce je „katalyzována“ přítomností nukleátorů snížení teploty vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách vede k osmotickému odsávání vody z buněk a tím k jejich dehydrataci a smršťování extra-cell. intra-cell. nukleátor solut Co se stane s vodou za pod-nulových teplot ?

31 EFŽ Intracelulární zmrznutí = smrt ? alespoň jeden druh háďátka, Panagrolaimus davidii, přežívá intracelulární zmrznutí obyvatel Antarktických půd mikorklimatické teploty se pohybují od +22*C (letní den) do -45*C (zimní noc) saturace mikroklimatu vodou se pohybuje od 0 do 100% háďátko přežije buď promrzlé (inokulace přes řitní otvor) nebo zcela dehydratované rovněž u izolovaných buněk tukového tělesa larvy vrtule Eurosta solidaginis bylo pozorováno přežití intracelulárního promrznutí...

32 EFŽ voda většinou nezačíná mrznout po dosažení rovnovážného bodu mrznutí, který odpovídá bodu tání (melting point, m.p.) hodnota bodu tání je koligativně (přímo úměrně) ovlivněná sumární koncentrací solutů = osmolalitou roztoku: 1 osmol/kg = m.p °K (°C) při teplotách pod m.p. voda zůstává v kapalné (podchlazené) fázi dokud nedojde k heterogenní či homogenní nukleaci ledu homogenní nukleace: spontánní zfomování nadkriticky velkého zárodečného krystalu ledu (při -5°C ~ molekul vody, při -40°C ~ 70 molekul) heterogenní nukleace: zformováni krystalu na vhodném povrchu (katalýza) po zformování zárodečného krystalu nastává jeho explozívní růst a mrznutí okolní vody  SCP, rychlé promrzání za současného uvolnění tepla bod podchlazení (supercooling point, SCP) = reálná teplota krystalizace vody stochastická veličina závislá na objemu vody, nukleátorech a čase Heterogenní nukleace Led v prostředí jako nukleátor ačkoli led nesnadno proniká přes kutikulu či přes lipidickou membránu (hydrofobní struktury), při kontaktu těla s ledem může dojít k nukleaci a promrznutí tělních tekutin skrze tělní otvory Bakteriální nukleátory lipoproteiny 120 – 180 kDa na povrchu membrány epifytních bakterií Pseudomonas syringae Erwinia herbicola Enterobacter aglomerans rozmístěny v agregacích, jež jsou nutné pro jejich nukleační aktivitu, adaptivní význam pro bakterie – poškození epitelu mrazem, zpřístupnění potravy dostávají se do střeva hmyzu a mohou iniciovat mrznutí obsahu střeva již při teplotách ~ -2°C Tělu vlastní nukleátory většinou nebyly přesně charakterizovány patrně určité epitopy membránových proteinů a/nebo lipoproteiny Tvorba ledu – mrznutí osa a osa c

33 EFŽ kapalná voda má maximální hustotu při teplotě +4ºC ohříváním nad tuto teplotu se hustota vody snižuje (obvyklý jev) zchlazovaním pod tuto teplotu se hustota vody také snižuje (anomální jev) reálná teplota krystalizace vody (tvorby ledu) například v rybníce se příliš neliší od 0ºC, protože rybník je velký, obsahuje mnoho hetero- genních nukleátorů a proto je pravděpodobnost vzniku ledu vysoká (voda tedy nedosahuje podchla- zeného stavu) voda o teplotě 4ºC klesá ke dnu neboť je hustší než voda o teplotě 0ºC. U dna rybníka je vyšší teplota než u hladiny (ledu) destilovanou vodu v menší nádobě můžeme podchladit až na přibližně -15ºC, aniž by vznikal led velmi malé objemy vody (nL a méně) lze podchladit až na teplotu přibližně -40ºC vodu v kapilárních pórech o nanometrových rozměrech se podařilo podchladit až na -110ºC (PNAS 104, 9570, 2007) podchlazená voda se rozpíná až do teploty -63ºC a teprve poté začíná houstnout molekuly vody v kapalné vodě molekuly vody v hexagonální krystalické mřížce ledu teplota vody u dna zamrzlého rybníka je vyšší než u hladiny (ledu) (Slavíček: Vesmír 87, , 2008) Anomální chování vody při poklesu teploty

34 EFŽ voda zůstává v kapalném stavu voda v extracelulárních prostorech se mění na led dochází k silné dehydrataci buněk aerobní metabolismus se zpomaluje, nikoli však zastavuje led brání difůzi kyslíku, anaerobní metabolismus buněk je minimální až nulový = kryobióza jsou např. udržovány transmembránové elektrochemické potenciály transmembránové elektrochemické potenciály zcela disipují hrozí ztráty vody voda je "konzervována" v ledových krystalech metabolismus je relativně aktivní : - vyžaduje přísun energie - vyžaduje koordinaci - je náchylný k poškození metabolismus je v hluboké supresi: - umožňuje šetřit energií - nevyžaduje koordinaci - je odolný vůči poškození Podchlazení vs. promrznutí Voda: Metabolismus:

35 EFŽ meta-analýza bodů podchlazení u ca. 350 druhů hmyzu strategie podchlazení strategie zmrznutí -60°C 0°C0°C 0°C0°C osa x: 11 habitatů seřazených podle "náročnosti" chladné sezóny (1 = tropy, 11 = kontinentální polární oblasti) osa y: teplota bodu podchlazení (0 až -60°C) korelace mezi teplotní náročností habitatu a hodnotou SCP byla nalezena pouze v případech: strategie podchlazení u druhů zimujících v částečně chráněných nebo nechráněných mikrohabitatech modré čáry vymezují SCP = -20°C na tuto hodnotu může poklesnout SCP u malých druhů hmyzu pouze díky odstranění heterogenních nukleátorů (Turnock and Fields, E.J.E. 102, , 2005) chráněné mikro-habitaty částečně chráněnénechráněné mikro-habitaty -20°C Bod podchlazení – supercooling point (SCP)

36 EFŽ Podchlazení – problém s desikací množství a složení kutikulárních lipidů bývá odlišné u nediapauzních a diapauzních stádií kukly Pieris rapae crucivora (bělásek řepový) bílé sloupce: nediapauzní černé sloupce: diapauzní diapauzní kukly P. rapae mají několikrát silnější vrstvu uhlovodíků na povrchu kutikuly: nediapauzní kukly:tloušťka 11 nm diapauzní kukly:tloušťka 195 nm mění se i kvantitativní zastoupení jednotlivých uhlovodíků: diapauzní kukly: 29:0  29:1  31:1  snižuje se podíl osmoticky aktivní, tzv. "volné" vody akumulací hydrofilních polymerů - glykogen (sval, tukové těleso) - hexamerní proteiny (hemolymfa) - LEA proteiny akumulací osmolytů - volné aminokyseliny (prolin) - cukry (trehalóza, glukóza,...) - polyoly (glycerol, sorbitol,...) metabolická suprese vede k zpomalení frekvence dýchání a tedy i k nižším respiračním ztrátám vody Kaneko and Katagiri, 2004 Naturwissenschaften 91,

37 EFŽ Podchlazení – problém s potenciály hmyz, přezimující v podchlazeném stavu musí udržovat iontovou homeostázu Kostal et al., 2004 J. Exp. Biol. 207, Pyrrhocoris apterus podchlazení zmrznutí hmyz, přezimující v promrzlém stavu rychle ztrácí elektrochemické potenciály, ale je schopen opět je rychle generovat po "roztání" Xylophagus cincta Kristiansen and Zachariassen, 2001 J. Insect Physiol. 47, Na+ K+ Mg++ vlevo: přežívání imag P. apterus za teploty -5  C vpravo: rovnovážné potenciály na membránách tukového tělesa P. apterus za teploty -5  C nd. wanon-diapause, warm-accl. d. wadiapause, warm-acclimated d. ca.diapause, cold-acclimated

38 EFŽ Podchlazení – problém se stabilitou stavu pouhým odstraněním nukleátorů se SCP sníží u mnoha druhů hmyzu na ~ -15 až -25°C (protože vodní kompartmenty jsou malé) podchlazený stav je však meta-stabilní a kdykoli může dojít k homogenní nukleaci Stabilizace podchlazeného stavu je nutná snížením mobility vodních molekul, díky zvýšení viskozity po částečné dehydrataci, popřípadě akumulaci osmolytů, relativním zvýšením frakce tzv. "vázané vody" v hydratačních obalech solutů a na hydrofilních površích (membrány, makromolekuly) většina hmyzu přezimuje v podchlazeném stavu a promrzá až při -15 až -50°C Akumulace Anti-Freeze proteinů (AFPs) regulace exprese AFP u Tenebrio molitor teplotou a fotoperiodou sezónní druhy up-regulují AFPs i po vystavení krátkému dni dalšími stimulátory jsou desikace a hladovění (AFP) Odstranění nukleátorů střevní (bakteriální ?) nukleátory jsou odstraňovány evakuací střeva, typickou pro nástup diapauzy mechanismy sekvestrace dalších (vnitrobuněčných) nukleátorů jsou prakticky neznámé (ostatně jako nukleátory samy)

39 EFŽ Anti-Freeze Proteins – AFPs AFPs hmyzu charakteristické repetitivní sekvence nalezeny u ca. 50 druhů hmyzu a také u roztočů, pavouků a stonožek poprvé byly AFPs charakterizovány u polárních ryb (DeVries, 1971) a později také u hmyzu (Duman, 1977) a rostlin schopnost adsorbovat se na povrch zárodečného krystalu a potlačit jeho růst při poklesu teploty pod m.p. v rozsahu ca. 2 až 8°K = termální hystereze brání růstu zárodečného krystalu podle osy c (tvoří se placky) schema aktivity AFPs a termální hystereze podchlazení zmrznutí stabilizují meta-stabilní podchlazený stav brání rekrystalizaci (spojování menších krystalů do větších)

40 EFŽ Doucet et al. (2009) Cell. Mol. Life Sci. vlevo: Tenebrio molitor (Coleoptera) – opakování motivu 12 aa, typický triplet Thr-Cys-Thr uprostřed: Choristoneura fumiferana (Lepidoptera) – motiv 15 aa s tripletem Thr-X-Thr vpravo: Hypogastrura harvei (Colembolla) – motiv Gly-Gly-X Struktura AFPs porovnání krystalové struktury tří různých typů hmyzích AFPs: společné vlastnosti všech tří typů: - repetitivní sekvence - opakující se motivy aminokyselin, ß-listů nebo α-šroubovic - zpevnění disulfidickými můstky a vodíkovými vazbami - „plochý“ povrch na jedné straně: adsorpce na ledový krystal

41 EFŽ Ice Nucelating Agents - INAs LÉTO ZIMA intra-celulární a intra-luminární nukleátory sezónně syntetizované nukleátory v hemolymfě také: Protein Ice Nucleators (PINs) - nukleátory objeveny u epifytických bakterií (Maki et al., 1974), a později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1978) kooperativní agregace INAs zvyšuje nukleační aktivitu scanning tunneling mikrofoto druhy hmyzu, které spoléhají na strategii promrznutí, je aktivně syntetizují a ukládají v hemolymfě před příchodem chladného období při poklesu teploty nehluboko pod 0°C promrzají Yeung et al., 1991 J. Vac. Sci. Technol. B9, Zachariassen, 1980 J. Comp. Physiol. 140, funkční podstata spočívá patrně ve vytváření "matrice", neboli katalytického povrchu, který je vhodný pro uspořádávání molekul vody do krystalové mřížky ledu podchlazení zmrznutí charakterizovány u larev tiplice Tipula trivittata globulární lipoproteiny o sumární velikosti ~ 800 kDa, průměru ~ 135 Ǻ proteinový dimer plus fosfatidylinositol obsahují repetitivní sekvence 16 aminokyselin

42 EFŽ Podchlazení – koligativní kryoprotektanty Gehrken, 1985 J. Insect Physiol. 31, Ips acuminatus koligativní deprese m.p. a SCP při vysokých koncentracích (> 1 M) m.p.: –1.86  C / 1 mol SCP:–2 až –6  C / 1 mol u glycerolu byly zaznamenány koncentrace až 5 M (460 g / L)  ca. 20 % sušiny je přeměmněno na glycerol (!!!)

43 EFŽ Podchlazení – ne-koligativní kryoprotektanty nekoligativní účinky při nízkých koncentracích (< 1 M) deprese m.p. a SCP je zanedbatelná Kostal and Simek, 2000 J. Insect Physiol. 46, u mnoha druhů hmyzu byla pozorována sezónní (zimní) akumulace polyolů v koncentracích < 1 M akumulace většinou dobře koreluje s maximem chladové odolnosti jaký je mechanismus účinku nízkých koncentrací ? (když ne koligativní) zimní akumulace sorbitolu a ribitolu v sumární koncentraci < 100 mM u přezimujících ploštic P. apterus

44 EFŽ Spouštěč akumulace polyolů je spouštěna poklesem teploty pod 5  C Korelace sumární koncentrace polyolů dobře koreluje s chladovou odolností Kostal and Slachta, 2001 Acta Soc. Zool. Boh. 65, Sezónní akumulace kryoprotektantů předběžnou podmínkou pro akumulaci je změna metabolismu spojená se vstupem do diapauzy vlastním spouštěčem akumulace je potom vystavení nízké teplotě – chladová aklimace velmi typicky je spouštěcí teplotou 5  C

45 EFŽ Průkaz nekoligativního účinku 250 ug 500 ug uL inj. buffer koncentrace polyolů: se zvýšila z 2.5 na 83.1 mOsmol.L -1 (byla dosažena typická zimní hodnota) bod podchlazení (SCP): se nezměnil (zůstal na -18.0°C) (koligativní účinky byly zanedbatelné) přežívání za -14°C/ 3d (chladová odolnost) se zvýšilo z 13.3 % na 41.5 % Kostal et al., 2001 Comp. Biochem. Physiol. B130, diapause adult (pre-acclimated) injikace polyolů do těla diapauzní ploštice změny po injikaci (po 1 dnu): nekoligativní účinek nízkých koncentrací polyolů byl takto přímo prokázán jakým mechanismem nízké koncentrace polyolů zvyšují chladovou odolnost ?

46 EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění základem je pozorování Hofmeistera z konce 19. století: některé ionty stabilizují proteiny (napomáhají jejich rozpuštění ve vodě) jiné de-stabilizují proteiny (napomáhají jejich vysrážení)  Hofmeistrovy řady solutů: později bylo zjištěno, že přírodní kompatibilní osmolyty a kryoprotektanty často obsahují právě stabilizující funkční skupiny (např. amino-skupiny) mechanismus různého účinku různých solutů zůstával dlouho neobjasněn teprve koncem 20. století bylo navržena hypotéza preferenčního vytěsnění kompatibilních solutů preferenční vytěsnění kryoprotektantů (disacharidy oranžově a prolin černě) z domény proteinu vede k preferenční hydrataci proteinu (N) a stabilizaci jeho funkční konformace hydratačním obalem

47 EFŽ de-stabilizing solutes  protein denaturation and aggregation stabilizing solutes  protein preferential hydration  stabilization Mechanismus preferenčního vytěsnění A a C) de-stabilizující soluty B a D) stabilizující soluty A a B) rozmístění molekul solutu C a D) vliv na strukturu proteinu empirická pozorování Timasheffa pomocí dialyzační membrány prokázala, že stabilizující soluty jsou vytěsňovány z okolí proteinu a tím je protein přednostně hydratován

48 EFŽ klíč k pochopení principu stabilizace je v termodynamice chování proteinu ve vodných roztocích N.... nativní protein U.... unfolded (denaturovaný) protein aq.. aquaeous (vodný) roztok os.. osmolyt ve vodném roztoku ΔG. změna volné energie systému přídavek osmolytu k nativnímu proteinu ve vodném roztoku vede paradoxně ke zvýšení jeho volné energie podstatné je, že denaturace proteinu chráně- ného osmolytem vyžaduje větší změnu volné energie než denaturace proteinu bez osmolytu N aq  U aq (ΔG1) < N os  U os (ΔG3) právě rozdíl ve změně volné energie je příčinou "nesnadnější" denaturace proteinu v systému s kryoprotektantem a tím také zvýšené stability proteinu ukázalo se však, že "chemické" mechanismy, jež jsou příčinou vytěsnění, nevysvětlují stabilizační efekt Mechanismus preferenčního vytěsnění

49 EFŽ nejčastěji se jedná o cukerné polyoly tedy deriváty glykolýzy: - etylén glykol (2C) - glycerol (3C) - threitol (4C) - ribitol (5C) - sorbitol (6C) - myo-inositol (6C) často také o cukry samotné: - fruktóza (6C) - glukóza (6C) - trehalóza (12C) pravděpodobně i volné aminokyseliny: - prolin cukry a polyoly jsou produkty degradace glykogenu většina druhů hmyzu buduje zásoby glykogenu v tukovém tělese v časných fázích diapauzy tyto zásoby mohou být zcela konvertovány na polyoly během přezimování tukové těleso Pyrrhocoris apterus (diapauzní imago) inter-konverze glykogenu a myo-inositolu u sluníček Epilachna sp. během přezimování glykogenová granule spouštěčem akumulace cukrů a polyolů je nízká teplota (práh většinou ~ 5°C) nízká teplota stimuluje (neznámým způsobem) prudký růst koncentrace cAMP v cytosolu, cAMP aktivuje protein kinázu A (PKA) a ta aktivuje kinázu fosforylázy, kináza aktivuje inaktivní formu b glykogen fosforylázy (GPáza) na aktivní formu a, aktivní forma a GPázy štěpí glykogen a tak produkuje uhlíkové skelety (glukózo-1P), které jsou dále přeměněny na polyoly... Biosyntéza kryoprotektantů

50 EFŽ Glycogen Glucose-1-P Glucose-6-P Fructose-6-P Fructose-1,6-bis-P 6-P-Glucono- lactone Glucose Fructose RiboseRibulose TCA cycle GPase (a+b) G 6 P-DH AR NADPH PoDH NAD+ ATP PFK-1 NADPHNADP+ NADH NAD+ CO 2 AR NADPH PoDH NAD+ KR NADPH R I B I T O L S O R B I T O L Kostal et al., 2004 J. Insect Physiol. 50, active metabolism diapause metabolism Biosyntéza kryoprotektantů diapauzní jedinci za nízkých teplot: aktivizace glykogen fosforylázy za teplot pod 5°C vyšší aktivita glukózo-6P-dehydrogenázy vyšší produkce NADPH vyšší aktivita aldózo reduktázy specifická aktivita ketózo reduktázy inhibice aktivity fosfofruktokinázy snížení toku uhlíku k TCA biosyntéza a akumulace ribitolu a sorbitolu aktivizace pentózového cyklu snížená aktivita polyol dehydrogenáz (kvůli nedostatku NAD+) glykolytický metabolismus prochází přestavbou při vstupu do diapauzy tak, aby mohl produkovat polyoly po vystavení chladu

51 EFŽ larvy vrtule Eurosta solidaginis přezimují v hálkách na zlatobýlech (Solidago) ve východní Kanadě tolerují promrznutí (tvorbu ledu) hromadění zplodin anaerobie úbytek zdrojů energie v promrzlém stavu (na obr. 12 týdnů při -16°C) vykazují známky anaerobního metabolismu glykogen po vstupu do diapauzy (konec léta) akumulují zásoby glukogenu které s nástupem nízkých teplot postupně konvertují na glycerol a potom sorbitol Promrznutí – kryoprotektanty glycerol sorbitol

52 EFŽ biosyntéza kryoprotektantů probíhá hlavně již před zmrznutím (chladová aklimace) ale (pomalu) pokračuje i po zmrznutí  anaerobní metabolismus (hromadí se laktát) většina druhů se strategií promrznutí spoléhá buď na inokulaci ledem z vnějšího prostředí nebo na biosyntézu nukleátorů do hemolymfy nutnou podmínkou je rovněž odstranění všech nukleátorů zevntiř buněk snížení teploty vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách vede k osmotickému odsávání vody z buněk a tím k jejich dehydrataci a smršťování právě schopnost přežít dehydrataci (zakoncentrování solutů) a zároveň zmenšení objemu buňky je kritickou adaptací pro strategii promrznutí extra-cell. intra-cell. nukleátor solut Úloha kryoprotektantů při promrznutí množství ledu, které se za danné teploty vytvoří, je vždy koligativně dáno osmolaritou roztoku kryoprotektanty zvyšují osmolaritu roztoku  snižují množství vody dostupné pro krystalizaci  snižují osmotické odsávání vody z buněk  regulují minimální objem buňky a tím brání jejímu mechanickému kolapsu  znižují zakoncentrování iontů v cytosolu a tím předcházejí denaturaci proteinů za danné teploty se v systému voda – kryoprotektant přemění menší množství vody na led než by tomu bylo v systému bez kryoprotektantu

53 EFŽ Promrzání znamená rychlé osmotické změny vyžaduje předběžnou aktivaci transportních systémů vody, glycerolu (kryoprotektantů) pozorováno např. u larev můry Chilo suppressalis (freeze-tolerantní, -25ºC) podmínkou pro přežití je: - vstup do diapauzy - chladová aklimace tukové těleso larvy (kontrola bez zásahu) barvení trypanovou modří prozrazuje poškození buněk zmrznutím -25º / 2 hod zamražení v mediu obsahujícím 0.25 M glycerol ne-diapauzní, ne-aklimované diapauzní, aklimované glycerol voda akvaporinový kanál je-li blokován HgCl2 (0.2 mM chlorid rtuťnatý) → tkáň odumírá promrzání je doprovázeno rychlým transportem vody ven z buněk (voda se připojuje ke krystalům ledu) a transportem glycerolu dovnitř buněk (potvrzeno pomocí radioaktivně značených molekul vody a glycerolu) (Izumi et al., 2007: J. Insect Physiol. 53, ) přežití akumulace glycerolu aktivace transportů

54 EFŽ Biologické membrány – častý cíl poškození gelová fáze je silně organizovaná gel crystalline phase (lamellar L ß ) hefagonální fáze je obrácená reversed phase (H II ) nízká teplota vysoká teplota vysoká fluidita rychlý laterální pohyb umožňuje změny konformace proteinů nízká fluidita (rigidita) pomalý pohyb proteiny nemohou fungovat rozpad membrány ztáíta funkcí změna teploty  změna fluidity  funkce proteinů  změna fáze  nefunkčnost proteinů  změna propustnosti membrána pracuje téměř jako teploměr – její vlastnosti jsou přímo závislé na teplotě: základní funkční fází je tekutá fáze liquid crystalline phase (lamellar L α )

55 EFŽ Přechod do gelové fáze při nízké teplotě pokles teploty zvýšení organizovanosti, snížení fluidity, zvýšení laterálního tlaku, omezení funkčnosti proteinů přechod do gelové fáze, vytěsnění proteinů na periférii gelové fáze, nefunkčnost proteinů integrovaný protein protože membrány mají velmi různorodé složení v horizontálnímm plánu, dochází ke tvorbě gelové fáze lokálně a potom spolu hraničí dvě fáze, fluidní a gelová na rozhraní obou fází dochází ke ztrátě bariérové funkce membrány prakticky okamžitý přesun iontů a solutů  nevratné poškození buňky

56 EFŽ snížením míry uspořádanosti  zvýšením fluidity desaturací MK zvýšením podílu PE zeslabením hydrofóbních interakcí změnou podílu cholesterolu (??) ten sice snižuje fluiditu membrány ale snižuje pravděpodobnost jejího přechodu do gelové fáze Jak zamezit přechodu do gelové fáze ? P headgroup P C16 C18 reshuffling zkrácení řetězců MK snížením podílu plasmalogenů ty mají typicky vysoký podíl dlouhých nasycených MK

57 EFŽ Pozor na hexagonální fázi ! zvýšení teploty se současnou dehydratací přechod do hexagonální fáze adjustace provedené za účelem zamezení přechodu do gelové fáze zvyšují pravděpodobnost přechodu do hexagonální fáze zejména zvyšování podílu PE s krátkými nenasycenými řetězci MK zvyšuje náchylnost membrány k přechodu do H II fáze

58 EFŽ Aklimační změny ve složení membrán shora jmenované adjustace membrán byly pozorovány u mnoha ektotermů, včetně hmyzu m/z Retention time příklad: HPLC/MS analysis of phospholipid composition in the fruit fly, D. melanogaster HPLC MS ,18 20,56 MS/MS fractionation Lyso-PE Lyso-PC PS PI PG PE PC SM DG quantification 575: PC 502, 520: C16:0 478, 496: C18:2 PC 16:0/18:2

59 EFŽ výsledky jsou však velmi komplexní a dosud jen z menší části je umíme adaptivně vysvětlovat... výsledky analýzy fosfolipidů u mušek D. melanogaster aklimovaných ve třech různých teplotách (nahoře) výsledky přežívacího pokusu v 0  C (vlevo dole) existuje funkční (kauzální) korelace mezi složením membrány a chladovou odolností ??? jakou část změny chladové odolnosti lze adaptivně vysvětlit pomocí změn ve složení biologických membrán ??? Aklimační změny ve složení membrán

60 EFŽ Homeoviskózní adaptace – základní paradigma poprvé formulována u bakterie Escherichia coli (Sinensky, 1974)  homeoviskózní adaptace (HVA): Aklimační změny, popřípadě evoluční rozdíly, pozorované ve fosfolipidickém složení biologických membrán různých živočichů jsou adaptivní: vedou k udržení konstantní viskozity (fluidity) membrány, jež je požadována pro optimální fungování integrovaných proteinů u mnoha poikilothermů (od bakterií přes rostliny a hmyz až po ryby) byly pozorovány typické změny ve složení membránových fosfolipidů (PL) po vystavení nízkým teplotám prostředí zároveň byla měřena "fluidita" membrány (sledováním difůze fluorescentních prob)  fluidita byla relativně stabilní za různých teplot empirie hypotéza testování byly provedeny analýzy na obou úrovních: - aklimační (fyziologická) - adaptivní (evoluční) hypotéza více-méně drží dodnes teorie existují však pozorování, která teorii nepodporují postupné úpravy teorie

61 EFŽ anisotropie fluorscentních prob DPH (di-fenyl hexatrien) nebo TPA jsou měřítkem "fluidity" membrány TbTb 20°C fluidita membrány je evolučně přesně naladěná k normální teplotě těla (prostředí) Teorie HVA fluidity membrán různých živočichů měřené za shodné teploty 20  C jsou různé protože jejich membrány jsou různé fluidity membrán různých živočichů měřené za jejich typických tělních teplot jsou podobné protože různé membrány potřebují podobnou fluiditu pro zajištění funkčnosti integrovaných proteinů

62 EFŽ HVA  HPA  DPB  LPO teorie protože všechna pozorování nezapadala do HVA, bylo postupně navrženo, že: - význam konkrétní hodnoty fluidity membrány není tak velký, jako význam konkrétní fáze membrány  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální fázi  teorie: Homeo-Phasic Adaptation = HPA - kromě nutnosti udržet fluidní fázi je důležité být stále stejně „blízko“ přechodu do hexagonální fáze a zároveň stále stejně „daleko“ od přechodu do gelové fáze - přechod do hexagonální fáze je totiž nutný pro normální fungování buňky - při všech membránových fůzích (vesikulární transporty, fagocytóza, pinocytóza) přechodně a regulovaně vzniká hexagonální fáze – to je třeba udržet -přechod do gelové fáze je považován za nežádoucí a letální – tomu je třeba se vyhnout  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální fázi a vzdálenost od přechodů  teorie: Dynamic Phase Behaviour = DPB (konzervace fázové dynamiky membrány) -kromě všeho ostatního (viz shora) je potřeba zachovat zcela určitou náchylnost membránových lipidů k peroxidaci  organismy se snaží udržet (evolučně i fyziologicky) optimální náchylnost k peroxidaci  teorie: Lipid PerOxidation = LPO

63 EFŽ Teorie DPB tato teorie v současnosti asi nejlépe vysvětluje empirická pozorování předmětem aklimační změny (evoluční adaptace) je zachování "vzdálenosti" T b od fázových přechodů změna „nastavení“ po náhlé změně teploty po zvýšení teploty se membrána dostala příliš „blízko“ přechodu do hexagonální fáze následná aklimace (změna složení) vedla k návratu na původní nastavení... analogicky pro přechod do gelové fáze

64 EFŽ nenasycené mastné kyseliny (UFAs) jsou mnohonásobně (5x až 40x) náchylnější k oxidaci vlivem ROS než saturované mastné kyseliny (SFAa) podobně PEs jsou náchylnější než PCs zvýšení obsahu UFAa a PEs (typicky pozorované v chladu) může pomáhat pro zachování zcela určité, fyziologicky vhodné hladiny oxidace mastných kyselin příliš rychlá oxidace = řetězová nekontrolovatelná tvorba lipidových radikálů = poškození membrány příliš pomalá oxidace = nízká hladina oxidovaných produktů MK zpomaluje průběh některých buněčných funkcí (tvorba eikosanoidů, buněčná signalizace, vesikulární provoz,...) = poškození funkcí buňky Schéma hypotézy: obrázek ukazuje, že míra LPO je u dvou různých organizmů shodná, je-li měřená za typických fyziologických teplot (Tb) jestliže se teplota zvyšuje, míra LPO se zvyšuje (protože vzniká více ROS) jestliže teplota klesá, míra LPO také klesá takže relativně nízká hladina UFAs a PEs za vyššich teplot může chránit membranu před oxidativním poškozením PUFAs a naopak relativně vysoká hladina UFAs a PEs za nižších teplot může pomáhat udržet potřebné buněčné procesy, které vyžadují regulovanou tvorbu lipidových radikálů (Crockett., 2008: J. Comp. Physiol. B178, ) Teorie LPO TbTb TbTb

65 EFŽ membrány promrzajícího hmyzu musí navíc vydržet elastické šoky spojené s dehydratací a musí odolat vzájemnému fůzování při těsném vzájemném přiblížení po dehydrataci "water replacement„ hypothesis Crowe et al., 1987 Biochem. J. 242, 1-10 Kostal et al., 2003 Comp. Biochem. Physiol. B135, Membrány promrzajícího hmyzu pozorujeme podobné aklimační adjustace jako u podchlazených organizmů larva mušky Chymomyza costata při mrznutí dochází k dehydrataci buněk a tedy i membrán hlavové části fosfolipidů se mohou příliš přiblížit a membrána přechází do gelové fáze  negativní důsledky trehalóza přesně zapadá do struktury membrány a nahrazuje chybějící molekuly vody...

66 EFŽ membrány přecházejí do fázového stavu gelu a mohou vzájemně fůzovat disacharidy udržují fázi membrán tekutou a brání jejich fůzi - trehalóza Bryant et al., 2001 Seed Sci. Res. 11, trehalóza Trehalóza – Water Replacement Theory akumulace trehalózy je poměrně typický jev pozorovaný u mnoha dehydratujících organismů disacharid dvou glukózových jednotek

67 EFŽ Udržení fluidity zásobních lipidů zásobní formou lipidů jsou triacylglyceroly (TGs) jejich fluidita je dána podílem nenasycených mastných kyselin (čím více – tím tekutější, olejovitější) fluidita je silně ovlivněná teplotou (čím nižší – tím tužší) pouze fluidní TGs jsou dostupné pro lipázy, jež od nich odštěpují mastné kyseliny chce-li živočich využívat své TGs jako zdroj energie za nízkých teplot - jeho TGs musí být za danné teploty ve fluidním stavu... glycerol mastné kyseliny TG lipáza fluidita zásobních TGs připravených pro přezimování je typicky vyšší než fluiditita „letních“ TGs analogie s HVA teorií platnou pro membránové fosfolipidy

68 EFŽ podrobněji v přednášce "Oxidativní stres" Racionále: při změnách teploty dochází ke změnám vlastností membrány  elektrony mohou "unikat" z řetězce oxidativní fosforylace na vnitřní mitochondriální membráně za vzniku ROS Aktivizace anti-ROS systémů náhlá změna teploty vede ke zvýšení aktivity anti-ROS systémů spolu s indukcí diapauzy může být anti-ROS systém aktivizován v předstihu zvýšenou tvorbu ROS lze očekávat nejen při snížení teploty, ale zejména při jejím opětovném zvýšení, kdy se prudce zvyšuje rychlost metabolismu, a přitom membrána nemusí být ještě optimálně re-adjustována na rychlou oxidativní fosforylaci organismy přezimující v podchlazeném stavu udržují aktivní metabolismus a tedy stále produkují ROS  musí udržovat / aktivizovat anti-ROS systémy: - superoxid dismutáza - kataláza - glutathion reduktáza - glutathion peroxidáza - glutathion-S-transferázy Aktivizace anti-oxidačních systémů podchlazení zmrznutí organismy přezimující v promrzlém stavu jsou ve velmi hluboké metabolické supresi a jejich metabolismus bývá anaerobní a tedy mají sníženou produkci ROS  teoreticky nemusí udržovat / aktivizovat anti-ROS  ovšem musí je mít připravené pro okamžik tání a náhlého zvýšení oxidativní respirace

69 EFŽ Aktivizace šokových proteinů - HSPs diapauses at pupal stage Hayward et al. (2005). J. Insect Physiol. 51, například u kukel masařky (Sarcophaga crassipalpis) akumulace šokových proteinů po vstupu do diapauzy byla pozorována u řady druhů hmyzu... zvýšení četnosti mRNA transkriptů Hsp23 a Hsp70 po vstupu do diapauzy (den 6 – 7) přetrvává po celou diapauzu (150 dnů) a mizí až při resumpci vývoje (RE), Hsp90 je downregulován, kognát Hsc70 se nemění (ND = nediapauzní kukly) a to i za stálé normální teploty 20  C !!!

70 EFŽ Aktivizace šokových proteinů - HSPs... ale ne u všech druhů hmyzu Tachibana et al. (2005). J. Insect Physiol. 51, například ne u larev masařky (Lucilia sericata)

71 EFŽ Rinehart et al. (2007): PNAS 104, (Sarcophaga crassipalpis) -15  /1 day45  /1 hour HSPs – reparace chladového poškození RNAi suprese téměř potlačila expresi genů hsp70 a hsp70 kukly s potlačenou expresí šokových proteinů vykazovaly: nižší odolnost vůči vysokým teplotám nižší odolnost vůči nízkým teplotám (bez zmrznutí) akumulované šokové proteiny mohou sloužit k reparaci chladového poškození

72 EFŽ mikrotubuly průměr ca 25 nm α a  tubulin polarizace (α minus –  plus ) centrozóm organizace buńky mitotické vřeténko pohyb kinesinů (k +) pohyb dyneinů (k -) mikrofilamenta průměr 5 – 9 nm G-aktin  F-aktin polarizace (plus konec přirůstá) struktura výběžků buněčný kortex pohyb myosinu intermediární filamenta průměr 10 nm heterogenní keratiny, lamininy síťovitá struktura mechanická pevnost za nízkých teplot obecně dochází k dezintegraci proteinových polymerů rozpad vláken tubulinu a aktinu za nízkých teplot byl pozorován u rostlin, a také u homeotermních živočichů poikilotermové (antarktické ryby a obrvenky) rozpadu předcházejí HSPs stabilizují cytoskeleton (a bývají up-regulovány v dormanci) pro hmyz dosud nemáme příliš jasná data... Ochrana cytoskeletu běžná teplota depolymerace různých enzymatických komplexů je kole 0  C

73 EFŽ Depolymerace aktinu v Malpighických trubicích kukel květilky Delia antiqua, které nebyly v diapauze a nebyly chladově aklimovány byl pozorován rozpad aktinu po vystavení chladu (-20  C/12 d) vlevo: barvení trypanovou modří naznačuje, že došlo k poškození membrány (trypanová modř nepro- chází membránou...) vpravo: barvení F-aktinu pomocí TRITC phalloidinu; je vidět rozptýlené skvny = nesouvislá síť F-aktinu chladová aklimace nediapauzních kukel a také vstup do diapauzy (bez chladové aklimace) vedly ke stabilizaci struktury F-aktinu Kayukawa, Ishikawa (2010)

74 EFŽ ve střevě komára Culex pipens byla pozorována restrukturace aktinu při chladové aklimaci exprese aktinových genů byla silnější v diapauze a po aklimaci docházelo ke zvýšené polymeraci aktinu polymerace postupovala směrem od křížení svalových vláken Aklimační restrukturace aktinu (Kim et al., J. Insect Physiol. 52, , 2006) ND25non-diapause, 25  C D18diapause, 18  C -5  C 12hcold-acclimation

75 EFŽ Dehydratace tato strategie byla původně popsána (1994) u kokonů žížal (Lumbricidae) později nalezena i u chvostoskoků patrně je široce rozšířena u půdní mikrofauny, která je charakteristická velmi permeabilní kutikulou pro vodu po vytvoření ledu v půdě je tlak vodní páry nad osmoticky aktivní (volnou) vodou v organismu vyšší než tlak vodní páry nad ledem  voda se odpařuje skrze propustnou kutikulu a připojuje se k ledu  organismus rychle dehydruje (ztrácí až 97 % tělní vody) zároveň se syntetizují kryoprotektanty  roztok uvnitř buněk se zahušťuje a nepromrzá podobnost se strategií zmrznutí s tím rozdílem, že voda se připojuje ke krystalům ledu, které jsou vně organismu Rychlá chladová aklimace krátké vystavení neletální, avšak nízké teplotě zlepšuje následné přežívání ve velmi nízkých (jinak letálních) teplotách popsáno (1987) u masařek Sarcophaga crassipalpis posléze nalezena u velkého množství druhů hmyzu vyskytuje se i u nediapauzních stádií hmyzu (zatímco schopnost komplexní "pomalé" chladové aklimace, na ktyerou se budeme převážně soustřeďovat, je většinou omezena jen na dormantní - diapauzní jedince) Mechanismy akumulace glycerolu prahová teplota pro iniciaci akumulace glycerolu je relativně vysoká (~ 15°C) (zdrojem uhlíku může být β-oxidace mastných kyselin) syntéza HSPs tepelný šok (vystavení subletální vysoké teplotě) poskytuje ochranu před následovným chladovým poškozením, aniž by se akumuloval glycerol,  ochranu poskytují syntetizované HSPs rychlá změna složení membrán otázka je, jak rychle může k restrukturaci docházet ? Dehydratace a RCH

76 EFŽ Termální biologie ektotermních obratlovců podobně jako u bezobratlých, také u terestrických obratlovčích ektotermů převládá poikilotermie avšak plazi mají dobře zvládnutou behaviorální termoregulaci, která je fyziologicky založená na duálním termostatu v hypotalamu (podobně jako u ptáků a savců) termoregulace na ca. 34  C u zmije růžkaté (Vipera ammodytes) za různého počasí letního dne: A) zataženo B) střídavě oblačno C) slunečno, horko Girons (1980): Tuatara 24, na slunci vzduch v noře

77 EFŽ Behaviorální termoregulace plazů pokud se plaz nachází v prostředí s vhodným termálním gradientem, potom může velmi účinně termoregulovat typická preferovaná tělní teplota se pohybuje od 30 do 35  C denní a noční prefernece se budou lišit v noci dávají přednost chladnějšímu prostředí s cílem ušetřit metabolickou energii příklady termoregulace několika druhů evropských plazů v laboratorních podmínkách plazi byli umístěni v prostředí s termálním gradientem šedé úsečky značí noc (skotofázi) Girons (1980): Tuatara 24, slepýš křehký (Anguis fragilis) vyhledává potravu (žížaly) převážně ráno a večer – tehdy udržuje vyšší teplotu. Po zbytek dne naopak šetří energii za nižší tělní teploty...

78 EFŽ Geografické limity ektotermie ? obecně platí, že s přibývající zeměpisnou šířkou (a také nadmořskou výškou) ubývá druhová diverzita ovšem toto pravidlo platí jak pro ekto- tak také pro endo-termy některé druhy ektotermů jsou velmi dobře evolučně adaptovány pro přežití za polárními kruhy při započtení bezobratlých obývá polární oblasti rozhodně více druhů ektotermů než endotermů

79 Obojživelníci permeabilní pokožka  vazba na vlhké mikrohabitaty  hrozí inokulace ledem  hrozí promrznutí ? tolerance promrznutí byla dosud zjištěna u několika druhů žab (rody Rana a Hyla) a snad také mloků přežití až 14 dnů při -5 až -6°C max. 65 % vody je přeměněno na led ostatní: strategie podchlazení do teplot ca. -1 až -3°C Plazi nepropustná pokožka  možnost přezimování v sušších mikrohabitattech  většinou podchlazení tolerance promrznutí se patrně vyskytuje u některých želv (Terrapene carolina, T. ornata) a jejich mláďat v hnízdě (Chrysemis picta, Emydoidea blandigii, Malaclemys terrapin) a také u ještěrky Lacerta vivipara inokulace ledem přes kloaku, oko, nos a zranění teplotní limity podobné jako u obojživelníků u plazů se zimní dormantní stav nazývá brumace vyhledávání tepelně pufrovaných mikrohabitatů pro přezimování je primární strategií obojživelníků i plazů EFŽ Constrainy hlavních taxonů Ryby obývají teplotně homogení a dobře pufrované habitaty: oceány  moře  jezera a řeky  dočasné tůně tepelná izolace těla je ve vodě téměř nemožná kvůli rychlé výměně tepla vedením především silně prokrvené epitely žaber a trávicího ústrojí jsou a musí být v přímém styku s vodou polární ryby jsou nejlépe adaptovány pro udržení stálé aktivity i za teplot blízkých nule, popřípadě pod nulou temperátní ryby mají dobře vyvinutou sezonalitu zahrnující fotoperiodickou regulaci reprodukce a dormanci neznáme ryby, které by přežívaly promrznutí tělní vody (tedy zamrzlé v ledu...)

80 EFŽ Polární ryby nejlépe prostudovanou skupinou jsou ostnoploutvé ryby z podřádu Notothenioidei 5 – 8 čeledí: ledovkovití ((Nototheniidae) ledařkovití (Channichthyidae) celkem ca. 43 rodů, 122 druhů pouze 16 druhů tzv. „icefish“

81 je oddělen Antarktickou polární frontou (APF) od ostatních oceánů někdy je hrubě vymezován 60  j.š. AFP – chladnější povrchové vody, které putují směrem na sever od Antarktidy se zde potkávají s teplejšími sub-antarktickými vodami a ponořují se pod ně Jižní oceán tvoří asi 10 % světového oceánu ale žije zde jen asi 1 % druhů ryb (z toho 88 % je endemitních) 35 % všech druhů jsou notothenioidi: - 55 % všech druhů v zóně pod 0°C - až 90 % všech druhů v nejchladnějších zónách EFŽ Jižní polární oceán paleoklimatický záznam teploty povrchových vod oceánu ve vysokých jižních šířkách ukazuje setrvalý pokles v průběhu třetihor rozpad Gondwany, izolace Antarktidy od ostatní pevniny, formování APF evoluce Notothenidů APF je spojena se silným východním proudem tento proud vytváří otáčivé proudy ve Wedelově a Rossově moři při pobřeží větry ženou povrchové vody západně

82 adaptivní radiaci Notothenidů v Jižním oceánu patrně umožnil evoluční vynález AFGPs EFŽ Anti-freeze glykoproteiny - AFGPs osmolalita tělních tekutin u Notothenidů je zvýšená na 450 – 600 mOsm.L -1 rovnovážný bod mrznutí je tedy mezi –0.8 až -1.1  C teplota Jižního oceánu je však až -1.9  C epitel žaber je v přímém kontaktu s vodou i ledovými krystalky  pravděpodobnost promrznutí tělních tekutin je vysoká (celoživotní expozice) podchlazený stav je celoživotně udržován aktivitou AFGPs jejich biosyntéza a obrat stojí značnou energii AFGPs mají schopnost adsorbovat se na povrch zárodečných krystalů ledu a potlačit jejich růst pozorujeme rozdíl mezi rovnovážnými bodem tání a mrznutí = hysterezi termální hystereze je ca. 0.5 až 1.5  K N-acetyl glukosamin glukóza

83 nejlépe prostudovanou třídou jsou Type I AFPs nalezeny u Arktických platýsů a vranek α-helikální struktura, bohatá alaninem (> 60%) 4 repetitivní sekvence (11-mery), začínající threoninem mechanismus nevazebné interakce mezi proteinem a ledem není zcela jasný AFGPs jsou u Antarktických notothenioidů (řád Perciformes) jsou také u Arktických tresek (řád Gadiformes) molekulární sekvence velmi silně naznačují, že u obou skupin ryb se proteiny vyvinuly NEZÁVISLE, z rozdílných proteinů u notothenioidů je parentálním proteinem pankreatický trypsinogen, a k jejich evoluci došlo patrně před ca. 15 až 5 mil. lety, v období chladnutí a zamrzání Antarktického oceánu jde tedy u velmi řídce pozorovaný úkaz evoluční konvergence na molekulární úrovni codtreska flounderplatýs sculpinvranka sea ravenšpičatička smeltkoruška herringsleď poutsliznatka wolfishvlkouš EFŽ Konvergentní vývoj AF(G)Ps AF(G)Ps nejsou výlučnou specialitou Notothenidů... AFPs – pět strukturních tříd u různých ryb

84 EFŽ „Icefish“ nemají hemoglobin (!) jsou to jediní obratlovci bez hemoglobinu je to adaptace (???) jejich krev je bezbarvá má nízkou kapacitu kyslíku – ca. 0.7% (v/v) (ostatní Notothenidi – ca. 7%) (teplokrevní obratlovci – ca. 20 %) příčinou je delece DNA kódující část genu pro α-globin a celý ß-globin včetně nekódující DNA mezi oběma geny navíc některé druhy ztratily i funkční gen pro myoglobin: JAK s tímhle mohou žít ? jejich srdce je větší a výkonější jejich cévy mají větší průměr jejich cirkulace je rychlejší chladné polární vody jsou dobře nasycené kyslíkem a nízké teploty znamenají pomalý metabollismus

85 adjustace Km LDH pro pyruvát u několika druhů ryb a jednoho ještěra. Všiměte si, že Km je relativně stálá v rozmezí tělních teplot typických pro jednotlivé druhy (silné části čafr, barevná oblast) terciární struktura LDH s tmavě vyznačenými regiony, jež jsou podstatné pro konformační mobilitu proteinu. Například záměna alaninu za threonin na pozici 219 ve smyčce βJ-α1G zásadně ovlivní mobilitu celé helix α1G-α2G a tím se z "temperátního" enzymu stane "tropický„. EFŽ Další adaptace polárních ryb Adaptace proteinů studium molekulární struktury potvrdilo, že relativně malé změny v sekvenci amino- kyselin mají za následek zásadní změny termálního chování proteinů podrobně to bylo studováno na příkladech laktát dehydrogenázy a malát dehydrogenázy tyto enzymy mají zhruba podobnou substrátovou afinity a aktivitu u různých druhů ryb, jež obývají habitaty s různou teplotou pozorujeme tedy evoluční teplotní kompenzaci

86 Teplotní kompenzace aerobní kapacity ??? NENÍ žádná evoluční kompenzace teplotní závislosti rychlosti klidového metab. na úrovni celého organismu (ačkoli některá data ukazují, že může být... ???) NENÍ žádná kompenzace ani na úrovni izolovaných mitochondrií: EFŽ Aerobní kapacita – rychlost metabolismu Zmnožení mitochondrií je ale evidentní: čím nižší teplota habitatu, tím vyšší je hustota mitochondrií ve svalovém vláknu usedlé (demersální) ryby mají korelaci strmější hustota mitochondrií u antarktických ryb dosahuje 50 % plochy průřezu (tedy max. teor. limitu) kosterní sval savců má hustotu ca. 10% demersální pelagické

87 rychlý obrat "AFPs" a vysoký počet mitochondrií představují extra-náklady energie protože se ale zároveň nezvyšuje schopnost vyrábět energii (viz výše: ne-kompenzace aerobní kapacity), energie se asi musí někde šetřit – KDE? velký podíl spotřeby energie jde na vrub udržení elektrochemického potenciálu (funkce ATPáz) snížení plochy aktivních povrchů = snížení nákladů antarktické ryby mají velký průřez svalových vláken (100 μm pomalá, 600 μm rychlá) = úspora povrchu  úspora energie OVŠEM, velký průřez vláken = horší difůze kyslíku (kyslík je lépe rozpustný v lipidech než v cytosolu) TAKŽE, zmnožení mitochondrií může být spíše adaptací pro účinnější transport kyslíku (???) EFŽ Paradoxy vyšší hustoty mitochondrií na podporu této hypotézy lze dále uvést, že: mitochondrie vytváří retikulární (síťovitou) strukturu vhodnou právě pro přenos kyslíku obsah tuku ve svalových vláknech je vyšší obsah poly-nenasycených mastných kyselin v mitochondriální membráně je značně zvýšený, což obojí opět vede k lepší rozpustnosti kyslíku a k jeho rychlejší difůzi svalovým vláknem ALE, nenasycené lipidy jsou velmi citlivé k peroxidaci, tedy k poškození vyvolanému volnými kyslíkovými radikály (ROS) jež vznikají jako vedlejší produkt oxidativního metabolismu jestliže tedy je mnoho mitochondrií se silně nenasycenými lipidy v membráně, hrozí peroxidace a ve výsledku buněčná smrt naštěstí (?) má nenasycená membrána také zvýšenou difůzní propustnost rovněž pro protony  protonový gradient se snižuje,  rychlost oxidativní fosforylace se snižuje,  produkce ROS se snižuje, (právě vysoký proton leak je pak další příčinou teplotní ne-kompenzace i při relativně vysokém počtu mitochondrií) ZÁVĚR: adaptace antarktických „icefish“ i jiných ryb ukazují na vyšší potřebu kompenzovat intracelulární transport kyslíku (i za cenu zvýšení možnosti poškození tvorbou ROS) spíše než kompenzovat aerobní oxidativní kapacitu

88 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb Reprodukce většina druhů ryb vykazuje určitý stupeň sezónnosti reprodukčního chování míra sezónnosti se zvyšuje s přibývající zeměpisnou šířkou a tedy s přibývající amplitudou sezónních klimatických výkyvů fotoperioda je hlavním faktorem regulujícím reprodukci ve vyšších zeměpisných šířkách, transdukce fotoperiodického signálu jde patrně přes ovlivnění biosyntézy melatoninu v pineální žláze mozku a přes ovlivnění produkce hypo- talamického faktoru uvolňujícího gonádo- tropní hormony z předního laloku hypofýzy fluktuace teploty mohou ovlivnit genovou expresi a proteinovou aktivitu v kritických bodech endokrinní kaskády přehled hierarchie faktorů regulujících reprodukci na ose zeměpisné šířky reprodukce

89 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb Kompenzace fyziologických funkcí za snížených teplot změny v abundanci proteinů jsou naopak obvyklé imunocytochemická lokalizace NaK ATPázy v žaberních lamelách Cyprinus carpio aklimovaných v nízké (vlevo) a vysoké (vpravo teplotě) v nízká teplotě vidíme mnohem více pump, adaptivním efektem je zřejmě udžení normální funkce za snížené teploty všimněte si také změny morfologie žaberních lamel... postupná chladová aklimace Cyprinus carpio vede k pozastavení transkripce isozymu Cds 1 desaturázy a naopak k up-regulaci isozymu Cds 2 v játrech adaptivním efektem je zřejmě adjustace rovnováhy mezi nenasycenými a nasycenými MK v membránách indukce exprese „sezónních isozymů“ je poměrně vzácná:

90 EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb např. u pstruha (Salmo trutta) tyto změny zahrnují: - zimní zvýšení oxidativní kapacity mitochondrií - vyšší zastoupení poly-nenasycených mastných kyselin (PUFA) v mitochondriální membráně - vyšší densitu záhybů vnitřní mitochondriální membr. - zvýšení obsahu tuku ve svalech výsledkem těchto změn je udržení schopnosti svalu pracovat i za nízkých teplot (i když výkonnost je nižší) svalové mitochondrie pstruha v létě (vlevo) a v zimě (vpravo). Viz vyšší hustotu "krist" v zimních mitochondriích Kompenzace aerobní kapacity Kompenzace produkce energie např. u kapra vidíme vyšší expresi genů podjednotek ATPsyntázy a cytochrómů za nízkých teplot

91 v.s. Dormance = úspora energie kompenzace fyziologických funkcí není udržitelná za všech podmínek teploty, dostupnosti kyslíku, potravy atd. některé druhy ryb kompenzují jen po určité teplotní prahy a pod nimi již upadají do dormantního stavu: evropský úhoř, Anguilla anguilla při poklesu teploty pod 8ºC přestává přijímat potravu a zahrabává se do bahna americký úhoř, Anguilla rostrata, se chová podobně. Pokusy ukázaly perfektní kompenzaci metabolismu v rozmezí teplot ºC. Naopak žádnou kompenzaci při teplotách pod 10ºC. Metabolická rychlost poklesla s Q 10 = 4.1 při poklesu teploty z 10 na 5ºC, což ukazuje na regulovanou metabolickou supresi. podobné závislosti byly zjištěny i u dalších druhů ryb: sumeček americký (Ameiurus nebulosus), halančík Fundulus heteroclitus karasi – extrémní tolerance k anoxii a nízké teplotě adaptivní význam dormance je zřejmý: úspora energie EFŽ Sezónní aklimatizace temperátních ryb Kompenzace produkce energie Anguilla anguilla Carrasius carrasius

92 celkem sledováno genů v 7 tkáních při 30°, 23°, 17° a 10°C černá = výchozí stav, červená = up-regulace, zelená = down-regulace Geny, jejichž transkripce byla změněna chladem je možno rozdělit do "funkčních" skupin: a) regulace transkripce, sestřihu RNA a translace, struktura a zpracovaní nukleových kyselin (40 genů) b) iontový transport, mitochondriální produkce ATP (37 genů) c) katabolismus proteinů, funkce proteasomů (35 genů) d) odpověď na stres: chaperoning, ROS-scavenging, apoptóza (21 genů) e) intermediární metabolismus včetně desaturace lipidů (18 genů) f) signalizace a přenos informace (13 genů) g) buněčná struktura, stabilita tubulinu (12 genů) Základní odpověď bylo zjištěno celkem 252 up-regulovaných transkriptů, které byly společné pro všech 7 tkání a pouze 8 down-regulovaných transkriptů tento poměr odpovídá základnímu paradigmatu chladové aklimace = za nižších teplot je potřeba kompenzovat úbytek aktivity zvýšením množství (proteinu, enzymu) Specifická odpověď dále bylo zjištěno celkem 3201 genů jejichž transkripce je ovlivněna chladem specificky podle jednotlivých tkání aklimace na chlad je:aktivní (upregulace) komplexní (značná část genómu) tkáňově specifická h) skupina down-regulavaných genů netvoří žádnou "funkční" skupinu EFŽ Sezónní aklimatizace kapra Analýza transkriptómu kapra

93 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky (Osmeridae). délka do 20 cm aktivní i v zimě pod ledem (T a ~ -1.8°C) živí se garnáty, různonožci (Amphipoda) a mnohoštětinatci (Polychaeta) Koruška (Osmerus mordax) Akumulace glycerolu Koruška je vyjímečná svou schopností akumulovat velké množství glycerolu ve všech tkáních (jen u třech dalších druhů ryb byla zjištěna podobná schopnost) spouštěčem je pokles teploty pod 5°C (aktivace glykogen fosforylázy b  a) zdrojem C pro počáteční akumulaci je glykogen (glukóza) glycerol velmi rychle přechází do vody (!), což vyžaduje neustálé doplňování zdrojem C pro doplňování hladiny jsou aminokyseliny (z přijaté potravy) sezónní průběh teploty a akumulace glycerolu v plazmě Osmerus mordax glycerol původní výskyt v pobřežních až brakických vodách severního atlantického pobřeží USA a Kanady introdukovaná do Velkých jezer i jinam

94 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky zvýšená transkripce a aktivita enzymů biosyntézy glycerolu: glycerofosfát dehydrogenázy (GPDH) aspartát- a alanin-aminotransferáz (AspAT a AlaAT) fosfoenolpyruvát karboxykinázy (PEPCK) zároveň je akumulován trimetylamin-oxid (TMAO) TMAO trimetylamin-oxid, organický osmolyt s kosmotropním účinkem a schopností stabilizovat proteiny při změně teploty akumulace glycerolu vyžaduje adjustaci metabolismu akumulace glycerolu a TMAO vede k sezónnímu zvýšení osmolality  koligativnímu snížení m.p.  oddálení možnosti promrznutí přesto se koruška v zimě nachází v podchlazeném stavu zdrojem energie a C-skeletů jsou aminokyseliny z potravy

95 EFŽ Sezónní aklimatizace korušky Biosyntéza AFPs sezónní akumulace AFPs v krvi začíná již na podzim (kdy je teplota vody ještě relativně vysoká) spouštěčem je patrně fotoperioda termální hystereze je relativně nízká (ca. 0.25°C) minimální úroveň termální hystereze pozorovaná v plazmě Osmerus mordax v průběhu zimy musí stačit ke stabilizaci podchlazeného stavu a k prevenci promrznutí ve vodě, která dosahuje teplot -1.9  C

96 EFŽ Obojživelníci přežívající promrznutí Hyla versicolor Hyla crucifer Pseudacris triseriata většina obojživelníků spoléhá na vyhledání vhodného úkrytu, kde je jednak vhodná vlhkost ale zároveň teplota neklesne pod rovnovážný bod tání tělních tekutin (-0.5  C) někteří dokáží mírně podchlazovat a přežít za teplot do -1.5  C skupina freeze-tolerantních druhů je patrně velmi malá, i když může zahrnovat více druhů, než je nám dnes známo

97 EFŽ Skokan lesní – rekordman promrznutí skokan lesni (Rana sylvatica) je nejlépe prostudovaným druhem a zároveň nejodolnějším dokáže přežít až 14 dnů za teploty do -6  C, kdy může být až 65 % jeho tělní vody přeměneno na led primárním předpokladem je (jako u všech freeze-tolerantních živočichů) zmrznout extracelulárně to zajišťuje led v mikrohabitatu, vysoká permeabilita pokožky a nukleační bakterie na pokožce a ve střevě vznikající led v mimobuněčném prostoru vede k zakoncentrování roztoku a tím pádem k osmotickému odsávání vody z buněk = k částečné dehydrataci buněk zároveň se syntetizuje, distribuuje a ukládá glukóza – kompatibilní osmolyt a kryoprotektant

98 zdrojem pro biosyntézu kryoprotektantů je glykogen - až 180 mg / g jaterní tkáně samotná nízká teplota nestačí ke spuštění biosyntézy rychlá konverze formy b  a glykogen fosforylázy pomalejší celkový nárůst aktivity glykogen fosforylázy  silná hyperglykémie krve (až ca. 500 mM) (normoglykémie: ca. 5 mM) EFŽ Kryoprotektanty žab většinou jde o glukózu, pouze u rosničky Rana versicolor byla zaznamenána akumulace glycerolu spouštěčem biosyntézy je promrznutí extracelulárních prostorů, receptor této události je neznámý, patrně jde o osmoreceptory v perifériích, transdukce signálu do jaterních buněk je neznámá glukóza je rozváděna krevním oběhem a vstupuje do buněk (které se předtím patřičně aklimačně připravily – transportéry glukózy) výsledkem je:  koligativní suprese m.p.  regulace míry dehydratace buněk  regulace minimálního objemu buňky s glukózou se za dané teploty vytvoří méně ledu než bez glukózy Rana sylvatica akumulace glukózy mmoles / kg tissue mmoles / L

99 Ještěrka živorodá (Lacerta vivipara) patří mezi plazi s nejsevernějším výskytem mírné pásmo Euroasie, výskyt až za polárním kruhem akumuluje glukózu v době přezimování - hodnoty glukózy u podchlazených ještěrek: krevní plazma15 mM játra22 mmoles / kg toleruje částečné promrznutí - hodnoty glukózy u promrzlých ještěrek: krevní plazma22 mM játra54 mmoles / Kg normoglykémie plazů je 6 – 7 mM (plazma) EFŽ Plazi obecně platí totéž co pro obojživelníky je otázkou, nakolik mírná hyperglykémie pozorovaná u plazů může skutečně ovlivnit úspěch přezimování koligativní působení je zcela zanedbatelné nekoligativní působení může zahrnovat jak zadržování vody tak také účinky na konformaci proteinů a membrán

100 Želva ozdobná (Chrysemis picta bellii (East)... marginata (West) čerstvě vylíhnuté želvičky v podchlazeném stavu snáší teploty až -12°C v promrzlém stavu snáší teploty až -4°C akumulují glukózu v plazmě: mM Glukóza je nejčastějším kryoprotektantem obratlovců výhody: má koligativní účinky na m.p. a SCP je to fermentovatelný substrát i za hypo- a anoxie má energeticky nenáročný metabolismus (nevyžaduje ATP pro uvolnění z glykogenu) je možná její rekonverze zpět na glykogen nevýhody: je to redukující cukr způsobuje glykaci (a tím poškození) proteinů video “tání“ zmrzlých želviček na adrese: EFŽ Želvy výskyt želvy ozdobné na větš. území USA a na jihu kanady belli marginata

101 Ochrana proti zvýšeným koncentracím ROS zejména za situací, kdy je zásobení tkání kyslíkem variabilní (mrznutí/tání, dočasné zaplavení, střídání teplot) je zvýšená tvorba ROS velkou hrozbou (náhlé zvýšení oxidace vzdušným kyslíkem musí být kompenzovánou dostatečnou kapacitou anti-ROS systémů) pozorujeme vysoké aktivity enzymů - superoxid dismutázy, - glutathion transferázy, proteinů - thioredoxin metabolitů - askorbát, - glutathion upregulace proteinů, které vážou železo - ferritin uvnitř buněk - transferin v plazmě je patrně součástí systému ochrany před ROS, protože volné ionty Fe++ by se jinak účastnily Fentonovy reakce za vzniku hydroxylových radikálů Změny metabolismu pro zajištění anaerobie týká se těch, kteří mohou být zaplaveni nebo mohou zmrznout aktivace glykogenolýzy nízkou teplotou (transdukce: PKA, HIF-1, MAPK) produkce glukózy jako energetického zdroje (nebo i na "export" jako kryoprotektantu) Ochrana před srážením krve bradykardie (při podchlazení) nebo totální zastavení oběhu (při promrznutí) vede kromě ischémie také ke zvýšení rizika srážení krve pozorujeme upregulaci serpinů (antithrombin, heparin cofactor II, complement inhibitor) jež brání koagulaci např. u želviček C. picta serpiny = kovalentní inhibitory plazmatických proteáz, jež se účastní kaskád srážení krve EFŽ Další fyziologické adjustace plazů

102 EFŽ Environmentální fyziologie živočichů Vladimír Košťál, 2009 Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav


Stáhnout ppt "EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009 ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České."

Podobné prezentace


Reklamy Google