Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17)

Prezentace na téma: "Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17)"— Transkript prezentace:

1 Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17)
Molekulární biologie 5. Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17)

2 Regulace genů transkribovaných PolII…
Složitější regulace než u prokaryot kvůli velkému genomu, jaderné membráně a posttranskripčním úpravám. Genom relativne nepristupny kvuli kompaktaci TF museji byt napred translatovany v cytoplazme a pak teprve do jadra mRNA export Regulace genů transkribovaných PolII…

3 Specifické transkripční faktory:
Vážou se na specifický úsek DNA v genomu (enhancery několik kb upstream nebo downstream od promotoru) Kontaktují transkripční aparát (přímo či nepřímo) a dovolují polymeráze opustit promotor a elongovat. Často přísně tkáňově a časově regulovaná exprese Vetsinou vazou velky zlabek (x TBP) TF – nazávislá DNA vazebná a aktivační doména

4 Mediátor Enhancery výtvářejí smyčky na DNA
komplex 26 proteinů (u člověka) sedící na polymeráze, místo kontaktu většiny specifických transkripčních faktorů integruje signál z různých aktivátorů a represorů a tlumočí ho polymeráze zprostředkovává vazbu specifických TF a PolII drží polymerázu připravenou na promotoru (poised state), dokuď nedostane signál z cytoplasmy k uvolnění a elongaci Samotna PolII s upstream proteiny nespusti transkripci, museji mit mediator CDK8 – složka mediátoru, fosforyluje CTD jako odpověď na vnější signál

5 Jak zabránit aktivátorům na enhanceru, aby regulovaly i vedlejší geny?
Insulátory sekvence DNA bohaté na GC, které rozdělují chromozom na samostatné regulační oblasti vážou několik kopií IBP proteinů (insulator binding proteins), například CTCF (CCCTC-binding factor) tvoří smyčky na DNA: pouze enhancery uvnitř smyčky mohou ovlivňovat geny uvnitř, aktivita vnějších enhancerů je blokovaná zároveň působí jako obrana proti šíření heterochromatinu Jeden enhancer může regulovat i více než jeden gen, ale pak si geny navzájem kompetují.

6 Insulátory lze inaktivovat metylací jejich GC vazebných míst
Paternálně zděděný lokus Imprinting H19/Igf2 lokusu metylace cytosinů v DMR1, DMR2 a ICR u otce brání vazbě CTCF na insulátor Enhancer se váže na promotor Igf2 genu Maternálně zděděný lokus u matky se díky CTCF vytvoří regulační smyčka znemožňující enahnceru aktivovat Igf2 gen, místo toho zapne H19 gen Taky SAR/MAR…

7 jaderná matrix (nuclear matrix)
síť filamentárních proteinů těsně pod jadernou membránou DNA na chromozomu je organizovaná do smyček, podobně jako u bakterií (300nm struktura) bakterie 40kpb na smyčku, eukaryota kbp oblast uchyceni k matrixu (matrix attachment regions, MAR neboli scaffold attachment regions, SAR) sekvence DNA bohaté na A/T, bp, rozeznávají ohyb DNA způsobený v oblastech DNA s mnoha A asociuje s topoisomerázou II, kontroluje kondenzaci smyčky asociace enhancerů, chromatin remodelujících faktorů polyA stretch samovolne uhnuty… MAR protein (matrix attachment regions protein)

8 Negativní regulace transkripce
Narozdíl od prokaryot neblokují represory nasednutí polymerázy, ale spíše brání nasednutí aktivátorů nebo iniciaci transkripce, nebo modifikují strukturu chromatinu gen pro testes specifický histon H2B u ježovky váže CTF aktivátor na CAAT box, umožní Oct1 proteinu kontaktovat mediátor a spustit transkipci Aby se testes specifické gen neexprimovaly už v embryu CDP CAAT displacement protein Exprimovován pod tkáňově specifickým promotorem pouze v embryu, brání příliš brzké expresi H2B genu

9 Mechanismus funkce represorů u eukaryot

10 (G) myoD transkripční aktivátor genů nutných pro specifikaci svalových buněk. bHLH protein vázající se na DNA jako heterodimer s E12 partnerem, oba mají DNA vazebou doménu ID protein může dimerizovat, ale nemá DNA vazebou doménu, myoD se nemůže vázat na DNA (v buňkách, které se nemají stát svaly) E12 taky bHLH ID protein negativně ovlivňuje transkripci, aniž by se vázal na DNA!

11 Heterochromatin x euchromatin
hustě kondenzovaná DNA s histony, nepřístupná polymeráze a proto netranskribovaná konstitutivní – ve všech buňkách daného organizmu fakultativní – při tkáňově specifickém umlčování genů euchromatin málo kondenzovaná DNA s histony, přístupná polymeráze a transkripčním regulacím Přístupnost chromatinu transkripčním faktorům a polymeráze hraje klíčovou roli při regulaci transkripce

12

13 Epigenetické modifikace histonových konců
Histone variants, exhange of variants Histone chaperons Konce histonů H2A,H2B,H3 and H4 vyčnívají ven z nukleosomu a jsou rozeznávány různými enzymy, které je kovalentně modifikují. Histonový kód Kovalentní modifikace slouží jako značky rozeznávané specifickými vazebnými proteiny, které mají vliv na kompaktaci DNA, transkripci, replikaci, rekombinaci, opravy DNA...

14 sumoylation metylace – postupná mono, di, tri metylace

15

16 arginin – metylace (mono, di, tri), deiminace (citrulin)
lysin – acetylace, metylace (mono, di, tri), monoubiquitinace, ADP ribosylace arginin – metylace (mono, di, tri), deiminace (citrulin) serin, threonin, tyrosin – fosforylace serin - palmitoylace prolin - isomerizace

17 Kdo modifikuje histony?
acetylázy deacetylázy methylázy demethylázy kinázy ubiquitin ligázy isomerázy Priklady znamych jmen? P300, HDAC, G9a…? Histon modifikující enzymy jsou přinášeny transkripčními faktory nebo rozeznávájí už existující modifikace

18 Acetylace histonů rozvolňuje chromatin
histon deacetylázy (HDAC) například HDAC1,2,3, Sir2 histon acetyl transferázy (HAT), například p300, CBP Ostatni modifikace ne jasny význam, zalezi na kterém zbytku na kterém histonu se provedou (metylace mono, di, tri…) Chromatin kompaktovaný, méně přístupný, histonové konce se vážou na sousedící histon. Acetylová skupina přidá negativní náboj na histonový konec, ten se odpoutá od sousedního histonu a tím rozvolní okolní chromatin

19 Trends in Pharmacological Sciences Volume 31, Issue 12 2010 605 - 617

20 Specifické modifikace histonů jsou rozeznávány proteiny se specifickými histon vazebnými doménami
Histonový kód a další…

21 Způsoby vazby proteinů na modifikované histony

22 Histonový kód je čtený histon vazebnými proteiny

23 aktivační modifikace H3, H4 acetylace H3K4tri-metylace
represní modifikace H3K9 tri-metylace H3K27 tri-metylace H4K20 tri-metylace bivalentní domény H3K4tri-metylace + H3K27tri-metylace Jeden nucleosom a jeden gen ma vetsinou bud pouze aktivacni nebo pouze represni modifikace, krome bivaletních genu… Neni to tak, za by metylace byla vzdy pozitivni nebo negativni, ani fosforylace atd.

24

25 Post-translační modifikace histonů slouží jako signály k regulaci struktury chromatinu a přístupnosti DNA Aktivační acetylace a metylace (H3K4/ K36/ K79) histon acetyltransferázy (HAT) Transkripčně aktivní ‘euchromatin’ Transkripčně utlumený ‘hetrochromatin’ Represivní metylace (H3K9/ K27) histon deacetylázy (HDAC) Nucleosomes consist of DNA (black line) wrapped around histone octomers (purple). Post-translational modification of histone tails by methylation (Me), phosphorylation (P) or acetylation (Ac) can alter the higher-order nucleosome structure. Nucleosome structure can be regulated by ATP-dependent chromatin remodellers (yellow cylinders), and the opposing actions of histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs). Methyl-binding proteins, such as the methyl-CpG-binding protein (MECP2), target methylated DNA (yellow) and recruit HDACs. a | DNA methylation and histone deacetylation induce a closed-chromatin configuration and transcriptional repression. b | Histone acetylation and demethylation of DNA relaxes chromatin, and allows transcriptional activation. Specifiké modifiace slouží jako značka pro vazbu dalších proteinů, které remodelují histony a strukturu celého chormatinu, což má vliv na přístupnost DNA pro transkripci a další děje. Tento‘kód’ se dědí i po dělení buňky a informace o kontrole exprese jsou tedy předávány ‘epigeneticky’

26 EPIGENETIKA = změny genové exprese zachované i po dělení buňky, které ale nejsou primárně kódovány sekvencí DNA posttranslační modifikace remodelace chromatinu imprinting inaktivace X-chromosomu Epigenetické mechanizmy = software DNA = hardware Genomic imprinting is a genetic phenomenon by which certain genes are expressed in a parent-of-origin-specific manner. It is an inheritance process independent of the classical Mendelian inheritance. Imprinted genes are either expressed only from the allele inherited from the mother (eg. H19 or CDKN1C), or in other instances from the allele inherited from the father (eg. IGF2). DOSAGE COMPENSATION is a mechanism by means of which the activity of X-linked or Z-linked GENEs is made equal in the two sexes of organisms with an XX compared to XY or ZZ compared to ZW basis of sex determination. In mammals, COMPENSATION is achieved by the inactivation of one X chromosome in somatic cells of females. In Drosophila, COMPENSATION does not involve inactivation. The two X chromosomes in females as well as the single X in males are regulated, and individual GENEs are thought to respond independently to the regulatory mechanism. It is proposed that in both groups of organisms the evolution of heteromorphic sex chromosomes was gradual and occurred as the direct result of the evolution of DOSAGE COMPENSATION rather than the reverse.

27 Šíření změn chromatinu podél chromozomu
pomocí ‘čtečky’ a ‘zapisovačky’ kódu

28 Bivalentní domény v embryonálních kmenových buňkách
In ES cells, differentiation and development-promoting genes (Dev. A, B, and C) are repressed by bivalent domains, whereas late differentiation genes are not marked by H3K27me3, but not expressed. Pluripotency genes such as OCT4 are methylated at H3K4 and expressed. Differentiation signals generate cells committed to various somatic lineages, and activate lineage-specific genes that lose the repressive H3K27me3 mark (Dev. A). However, many genes preserve the bivalent domains and are not expressed (Dev. B and C); a few of these genes (e.g., those that are selectively expressed in other somatic cell lineages) also gain promoter DNA methylation during lineage commitment to ensure silencing (Dev. C). Late differentiation genes become marked by H3K27 in a manner dependent on the particular committed cell type, resulting in the formation of new bivalent domains that may be resolved in more mature differentiated cells. Examples of the aforementioned dynamics during neuronal differentiation of ES cells are NEUROG1, encoding for a neurogenic transcription factor (Dev. A); GATA4, encoding for an endodermal marker (Dev. B); TPARP, encoding for a germline-specific polyadenylate polymerase (Dev. C); and SCN1B, encoding for a neuronal voltage-gated sodium channel (late diff. gene; Mohn et al., 2008). The population of de novo DNA-methylated genes is also enriched in pluripotency-specific genes such as OCT4, ensuring the stable repression of transcripts that are required for ES cell maintenance. Aktivační (K4trimetylace) i represní (K27trimetylace) modifikace na stejném chromozomu, s polymerázou připravenou k transkripci (poised polymerase). U důležitých vývojových genů, které je třeba rychle zapnout. Christophersen N S , and Helin K J Exp Med 2010;207:

29 Kdy dochází k modifikacím chromatinu?
během aktivace genů a transkripce při umlčení genů při imprintingu při inaktivaci X chromozomu při opravě DNA při rekombinaci při replikaci DNA

30 Chromatinové modifikace během transkripčního cyklu
Vazba aktivátorů na jejich rozpoznávací sekvence v enhancerech genů určených pro aktivaci Aktivátory rekrutují ko-aktivátory jako je mediátorový komplex, acetyltransferázový komplex (např.SAGA), který acetyluje histony okolo počátku transkripce. Také chromatin remodelující komplex (např.SWI/SNF), který posune nebo vytěsní histony kolem počátku transkripce. .

31 Rekrutování bazálních TF a polymerázy, sestavení iniciačního komplexu
TFIIH fosforyluje Ser5 v CTD doméně PolII. Helikáza rozvine bazí DNA sloužící jako templát pro polymerázu. Monoubiquitinace H2B (Bre1) a následná H3K4 trimetylace histonů okolo místa počátku transkripce (Set1). Uvolnění polymerázy a elongace.

32 NELF a DSIF se vážou na polymerázu některých genů krátce po začátku elongace (promoter proximal pause site), pauzující polymeráza (paused polymerase). Fosforylace Ser2 v CTD, DSIF a NELF díky P-TEF2 (positive transcription elongation factor 2)

33 CTD doména váže během elongace proteiny modifikující chromatin, například SETD2 trimetylující H3K36 a acetylázy. Histony před polymerázou musejí být odstraněny a za polymerázou opět navázány do nuklesomů –díky chromatin remodelujícím komplexům a histonovým chaperonům (např. FACT komplex) Specifické modifikace chromatinu ve specifických místech genu zajišťují, aby transkripce začala na definovaném místě promotoru (a ne třeba uvnitř genu). Modifikace také ovlivňují (alternativní) splicing.

34 nukleosomy s H2A.Z variantami
oblast bez nukleosomů nukleosomy s H2A.Z variantami nukleosomy s H3.3 variantami M. Smolle, J.L. Workman / Biochimica et Biophysica Acta 1829 (2013) 84–97

35 Histonové varianty Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích… Neplest si s různymi posttrasnlacnimi modifikacemi histonu, tyto jsou kodovany separatnimi geny

36 Histonové varianty Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích… H2A.Z - v nukleosomech obklopujících počátek transkripce většiny genů (-1 a +1 nukleosom) a enhancery - +1 nukleosom je přesně umístěné vzhledem k počátku transkripce, díky chromatin remodelujícím enzymům - stabilní asociace H2A.Z s DNA, pomáhají udržet ‘nukleosome free region’ v místě nasedání polymerázy - neváže histon H1 - acetylovaný pozitivně ovlivňuje transkripci, usnadňuje nasedání polymerázy - H2A.Z bez acetylace, nebo monoubiquitinovaný, je složkou heterochromatinu - někdy jako heterodimer H2A-H2B/H2A.Z-H2B na stejném nukleosomu

37 H2A.Z nukleozomy jsou aktivně umisťovány POUZE kolem počátku transkripce
Histone variant H2A.Z facilitates RNA polymerase II (RNAPII) recruitment, but randomly incorporated H2A.Z nucleosomes (magenta) in gene bodies might contribute to aberrant transcription initiation. b | Transcription causes the eviction of H2A.Z–H2B dimers and the preferential reassembly of H2A–H2B dimers, which might help prevent aberrant initiation in the short term. C. Targeted deposition of H2A.Z at promoters by a Swr1 homologue prevents their methylation, and, conversely, DNA methylation over gene bodies inhibits the misincorporation of H2A.Z, thus enforcing the distinction between promoters (which must be kept depleted of nucleosomes) and gene bodies (which require stable nucleosomes to avoid aberrant initiation).

38 CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru
H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = gH2A.X - fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě reparačních a remodelačních enzymů - remodeling a inaktivace sex chromozomů CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3) CENP-A nukleozom Histone chaperons – bring histone varinats to the remodelling enzymes…

39 CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru
H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = gH2A.X - fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě reparačních a remodelačních enzymů - remodeling a inaktivace sex chromozomů CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3) H složkou aktivně transkribovaných genů, enhancerů a promotorů, kde jsou histony aktivně odstraňovány a opět inkorporovány MacroH2A – nehistonová ‘makrodoména’na C-konci - makrodoména může být poly-ADP-ribosylována pomocí PARP1 enyzmu (poly-ADP-rinosyl transferáza), snižuje transkripci a vede k represi genů H2A.Bbd – ‘H2A Barr body deficient’ (chybí na inaktivním X-chromozomu) - chybí C-konec postranslačně modifikovaný u klasického H2A - v transkripčně aktivních genech hlavně v mozku a varlatech Histone chaperons – bring histone varinats to the remodelling enzymes… Histonové varianty jsou přidávané na DNA až po replikaci DNA, během replikace jsou vždy inkorporovány normální H3.

40 Protaminy - analogy histonů ve spermiích, spolu s histonovými variantami specifickými pouze pro spermie nahrazují většinu normálních nukleosomů a kompaktují genom. Je důležité vymazat epigenetické modifikace otce před oplozením vajíčka. Většina eukryot má pouze jednu formu H4 a H2B (trypanozoma dvě formy od každého histonu)

41 ATP dependentní chromatin remodelující komplexy
Nukleosomy mohou bránit přístupu TF a tím bránit transkripci. Nucleosomes can impede the access of trans-acting factors to their target sites on the chromosome and keep transcription inactive (top). Under appropriate conditions, pioneer transcription factors (TFs, green pentagon) can bind to their targets in nucleosomal DNA and displace nucleosomes and allow other TFs and RNA polymerase II (RNAPII) to access their sites, often by recruiting ATP-dependent chromatin remodelers (bottom). ‘Pionýrské’ transkripční faktory mohou vázat DNA i na nukleosomech a pomocí chromatin remodelujícíh komplexů odstranit nebo posunout histony kolem počátku transkripce a umožnit tak sestavení iniciačního komplexu.

42 Mechanismus remodelace chromatinu
1. nucleosome sliding

43 Vzájemně se nevylučující mechanismy.
1. 2. (remodelling) 3. Schematic model depicting different modes of ATP-dependent chromatin remodeling. ATP-dependent chromatin remodeling complexes use the energy derived from ATP hydrolysis to alter histone-DNA contacts in such a way that (A) nucleosomes slide to another position, (B) a remodeled state is created in which the DNA becomes more accessible but histones remain bound, (C) DNA and histones dissociate completely, or (D) histone (variant) replacement. It should be noted that these distinct modes of chromatin remodeling are not necessarily incompatible. In all cases, the DNA accessibility at a given position has been changed as a consequence of the activity of an ATP-dependent remodeling factor. 4. Vzájemně se nevylučující mechanismy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression Volume 1681, Issues 2–

44 Nukleozomy existují v dynamické rovnováze, chromatin remodelující enzymy pouze posunují rovnováhu určitým směrem

45 Chromatin remodelující komplexy
4 rodiny: SWI/SNF, ISWI, Mi-2, INO80 Switch/sniff a imitation switch (ISWI) Switching of mating type loci in yeast…

46 Pořadí nasedání TF, HAT a remodelujících komplexů se liší od typu promotoru
Nejčastější scénář: Transkripční faktor váže DNA Histon acetyl transferáza (HAT) se váže na TF HAT acetyluje okolní histony a rozvolní chromatin Chromatin remodelující komplexy se vážou na TF nebo přímo na histony a přesouvají je, aby zpřístupnily DNA Vážou se další transkripční faktory Vazba polymerázy K iniciace je potřeba pozitivní signál od specifických transkripčních faktorů přes mediátorový komplex

47 A) The HO endonuclease gene of yeast is covered by nucleosomes
A) The HO endonuclease gene of yeast is covered by nucleosomes. B) The transcription factor Swi5p binds to the DNA. C) This is followed by binding of the Swi/Snf complex to Swi5p. D) The remodeled nucleosomes allow binding of an acetyl transferase, SAGA, to the Swi/Snf complex and to a nucleosome. E) As the acetylated histones become less compact the SBF transcription factor binds. F) The transcription apparatus binds.

48 Polycomb a HP1 fakultativní heterochromatin
UMLČOVÁNÍ TRANSKRIPCE (gene silencing) Cílené zastavení transkripce specifických úseků DNA: HP1 and Polycomb silencing Polycomb a HP1 fakultativní heterochromatin BLACK chromatin specifické histonové modifikace vedoucí ke kompaktaci chromatinu a jeho znepřístupnění pro TF a polymerázu role DNA modifikujících proteinů + metylace DNA Dva hlavni typy: Polycomb silencing a HP1 silencing Role RNAi a long ncRNA v review Renato Paro 2011 BLACK chromatin – zatím prokázán jen v Drosophile, asociovaný s jadernou laminou, 48% genomu, bez HP1 a Polycomb, hodně H1, umlčené geny aktivní během vývoje organizmu Nature review genetics (12) 2011

49 Vznik a šíření fakultativního heterochromatinu přes HP1 protein
Iniciace heterochromatinu vazbou Kruppel associated box domain zinc finger proteins (KRAB-ZFP) Velká rodina transkripčních faktorů (asi 350 u člověka), vážou nas sebe KAP1 (KRAB-associated protein1), který je místem k navázání heterochromatin proteinu 1 (HP1) a H3K9 trimetyláz (H3K9 trimetyláza) KRAB KAP1 histon 3 K9 trimetylace Šíření heterochromatinu oběma směry!

50 Šíření heterochromatinu přes Polycomb group proteiny
PRE – polycomb response element na DNA, váže PRC1, PRC2 nebo PhoRC komplexy 1. Specifické transkripční faktory nebo ncRNA rekrutují PRC2 komplex H3 K27 trimetylace 2. sám PRC2 se váže na H3K27 tri, (šíření heterochromatinu) Noncoding RNAs, hlavne long noncoding RNAs, taky RNAi 3. H3 K27 trimetylace umožní vazbu PRC1 komplexu a ubiquitinace H2A K119 Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008

51 4. Deacetylace histonů (H3 a H4)
5. metylace DNA Kompaktace chromatinu, brání přístupu dalších chromatin modifikujících proteinů a polymerázy. Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008

52 Poziční efekt (position effect variegation)
Šíření heterochromatinu z centromerických nebo telomerických oblastí nebo v blízkosti inaktivovaných transpozonů Locus control regions…. ? Bez specifických inzulátorů by se chromatin šířil dále po chromozomu.

53 Polycomb komplexy řídí expresi mnoha vývojových genů
Například Hox genů (homeotických genů) Geny řídící identititu jednotlivých segmentů embrya podél anterio-posteriální osy Transkripční faktory s homeobox doménou (vazba DNA), řídí expresi genů pro vývoj hlavy, oka, křídel atd. Jednotlive Hox geny muzou pusobit jako aktivatory urcitych genu a zároven represory jinych!! Genové klastry, kde pořadí na chromozomu odpovídá pořadí exprese v embryu = kolineární exprese Drosophila dva klastry ne stejném chromozomu, vyšší organizmy několik klusterů na různých chromozomech

54 jednu část těla v jinou (= ‘Antennapedia’ and ‘bithorax’)
Objevené na Drosophile jakožto ‘homeotické’ mutace, tedy mutace transformující jednu část těla v jinou (= ‘Antennapedia’ and ‘bithorax’) wild type Antp bx Ne vsechny Hox geny jsou homeoticke a ne vsechny homeoticke geny jsou pouze Hox (treba eyless neni Hox gen)

55 Exprese homeotických genů působí jako trvalé označení polohy dané buňky podél anterio-posteriální osy Ačkoliv exprese homeotických genů probíhá v rané embryogenezi, označí polohu buňky a předurčí ji k vývoji určitým směrem (t.j. k vývoji určitého orgánu) mnohem později během embryonílního vývoje Jak si buňka tuto informaci pamatuje? The descendent cells now know how they should differentiate despite never actually being exposed to the differentiating stimulus Remodelace chromatinu Polycomb group proteiny X Trithorax group proteiny The Hox Complex Carries a Permanent Record of Positional Information The spatial pattern of expression of the genes in the Hox complex is set up by signals acting early in development, but the consequences are long-lasting. Although the pattern of expression undergoes complex adjustments as development proceeds, the Hox complex behaves in each cell as though stamped with a permanent record of the anteroposterior position that the cell occupied in the early embryo. In this way, the cells of each segment are equipped with a longterm memory of their location along the anteroposterior axis of the body—in other words, with an anteroposterior positional value. As we shall see in the next section, the memory trace imprinted on the Hox complex governs the segmentspecific identity not only of the larval segments, but also of the structures of the adult fly, which are generated at a much later stage from the larval imaginal discs and other nests of imaginal precursor cells in the larva. The molecular mechanism of the cell memory for this positional information relies on two types of regulatory inputs. One is from the homeotic selector genes themselves: many of the Hox proteins autoactivate the transcription of their own genes. Another crucial input is from two large complementary sets of proteins that control chromatin structure, called the Polycomb group and the Trithorax group. If these regulators are defective, the pattern of expression of the homeotic selector genes is set up correctly at first but is not correctly maintained as the embryo grows older. The two sets of regulators act in opposite ways. Trithorax group proteins are needed to maintain the transcription of Hox genes in cells where transcription has already been switched on. In contrast, Polycomb group proteins form stable complexes that bind to the chromatin of the Hox complex and maintain the repressed state in cells where Hox genes have not been activated at the critical time. The developmental memory involves specific covalent modifications of histones in nucleosomes in the neighborhood of the Hox genes, leading to changes in the state of the chromatin that can be perpetuated from one cell generation to the next. Posttranslační histonové modifikace

56 Metylace DNA u prokaryot metylace označuje nově vzniklé DNA vlákno během replikace u eukaryot metylace slouží k umlčení genové exprese Metylace cytosinů Deaminaci cytosinu vznikne thymin… cytosin 5-metyl-cytosin 10% genomu u živočichů, 30% genomu rostlin

57 Metylázy a demetylázy krátká rotpoznávací sekvence pro metylázy
CG u živočichů, CNG u rostlin de novo metylázy demetylázy udržovací metylázy (pro zachování metylačních značek během replikace) DNA metylace je stabilní během buněčného dělení.

58 Umlčování genové exprese je často spojeno s metylací DNA
Dva mechanizmy bránící expresi genů: CH3 skupiny míří do velkého žlábku a brání nasedání transkripčních faktorů MeCP – methyl cytosine binding protein váže se na CH3 skupiny a přináší s sebou deacetylázy kompaktace DNA

59 CpG ostrovy (CpG islands, CG islands)
oblasti s velkou hustotou CG sekvencí asi 40% promotorů leží v blízkosti CpG ostrovů aktivní geny mají CpG sekvence nemetylované (houskeeping geny) CpG ostrovy neaktivních genů jsou metylované tkáňově specifické geny mají sekvence metylované ve tkáních, kde nejsou exprimované, ale nemetylované ve tkáních, kde jsou exprimované nemetylovaná DNA metylovaná DNA

60 Metylační profil většiny genů je vymazán krátce po oplození vajíčka
Jak je stanoven nový metylační profil není příliš známo… Mechanismus de novo metylace není dobře znám… Několik genů nemá metylační značky vymazány - imprinting

61 Imprinting Metylační značky uniknou vymazání a reprogramovaní během embryogeneze Igf2 gen zděděný od matky je v somatických buňkách vždy metylovaný (neaktivní) Igf2 gen od otce je vždy nemetylovaný (aktivní) Bialelická exprese ostatních genů… U samicich gamet nemetylovane insulatory, tedy aktivni, odstini expresi Igf2 Pouze při formaci dalších vajíček budou obě alely Igf2 znovu metylované a ve spermiích obě demetylované.

62 Inaktivace X-chromozomu
Gen pro barvu srsti leží na X-chromozomu Calico kočka je heterozygotní pro tento gen (druhá alela je mutantní, neprodukuje barvivo) Náhodná inaktivace X-chromozomů Oblasti s bílou srstí mají inaktivovaný X chromozom s normální alelou a aktivní pouze X chromozom s mutantní alelou C.Elegans má poloviční expresi genů na obou X, Drosophila zdvojnasobi expresi X u samecka Samec vždy normální hnědý U savců, hub a rostlin kočka Calico

63 Xist gen (X-inactive specific transcript)
leží na X chromozomu nekóduje protein, ale pouze RNA metylovaný a tedy neaktivní na aktivním X chromozomu nemetylovaný a tedy aktivní na neaktivním X chromozomu přenesení Xist genu na jiný chromozom stačí k téměř úplné deaktivaci tohoto chromozomu metylovaný Xist gen aktivní Xist gen Jsou pořeba I jiné faktory, inaktivace prenesenim Xist genu není úplná… aktivní X chromozom neaktivní X chromozom

64 Na neaktivním X se začně více exprimovat Xist a utlumí se Tsix
aktivní X neaktivní X Oba Xist geny se mírně exprimují, stejně jako jejich antisense transkript Tsix 1. Tsix RNA Na aktivním X se začně více exprimovat Tsix, který utlumí expresi Xist = aktivní Tsix 2. Na neaktivním X se začně více exprimovat Xist a utlumí se Tsix = aktivní Xist Tsix RNA

65 K27 trimetylace, deacetylace H4, macro H2A histonová varianta
aktivní X neaktivní X Neaktivní X: Xist RNA postupně směrem od Xist genu pokryje chromozom, na kterém se nachází, váže PRC2 komplex, deacetylázy a další chromatin modifikující a DNA metylující proteiny 3. K27 trimetylace, deacetylace H4, macro H2A histonová varianta inaktivace téměř veškeré transkripce stabilní po zbytek života buňky 4. Mechanismus pokryvani neznamy, asi postupne sireni pres PRC2… Aktivní X: pouze Xist gen je metylovaný a tedy neaktivní, ostatní geny funkční Každá žena je genetická mozaika! Ani jednovaječná dvojčata nemusí být stejná…

66 Barrovo tělísko Heterochromatin naktivního X chromozomu viditelný pod světelným mikroskopem nebo při imunodetekci H3K27 Nekdy pouzivano na Olympijskych hrach na dukaz, ze zeny atletky jsou skutecne zeny, a ne prevleceni muzi, kteri by ale ziskali bodovou vyhodu… Ale XXY Klinefelteruv syndrom jsou muzi a meli by Barrovo telisko…

67 Imunoprecipitace pomocí protilátky proti 5-mC
Mapování metylovaných cytosinů v genomu Imunoprecipitace pomocí protilátky proti 5-mC Bisulfidické sekvenování

68 Buněčný metabolismus má výrazný vliv na transkripci
Mnoho transkripčních regulátorů potřebuje metabolity pro svou funkci. ATP chromatin remodelling enzymes O histon demethylases (JmJC) Trends in Biochemical Sciences November 2012, Vol. 37, No. 11

69 vliv na transkripci, ale i buněčnou signalizaci, replikaci atd.
Metabolismus je klíčový regulátor mnoha buněčných dějů hladovějící buňka rakovinná buňka normální buňka ATP : ADP O2 SAM a-KG ATP : ADP NAD+ : NADH O2 SAM a-KG ATP : ADP NAD+ : NADH O2 SAM a-KG NAD+ : NADH úroveň metabolismu ovlivní aktivitu proteinů, které potřebují metabolity jako substráty nebo kofaktory ke své činnosti vliv na transkripci, ale i buněčnou signalizaci, replikaci atd.

70 Mnoho proteinů působí mimo jiné jako metabolické sensory
regulace exprese metabolických genů metabolism transkripce signální dráhy replikace metabolické senzory buněčný metabolismus (HAT, Sir2, SWI/SNF….) ATP, NAD, acetylCoA, SAM, O2…

71 Laboratoř vývojové biologie a genetiky Krejci lab Zorana Vujin
Raquel Perez-Gomez Matej Horvath Laboratoř vývojové biologie a genetiky Pavel Steffal Vera Slaninova Vladka Tuckova