Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17) 5. Molekulární biologie.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17) 5. Molekulární biologie."— Transkript prezentace:

1 Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17) 5. Molekulární biologie

2 Složitější regulace než u prokaryot kvůli velkému genomu, jaderné membráně a posttranskripčním úpravám. Regulace genů transkribovaných PolII…

3 Specifické transkripční faktory : 1.Vážou se na specifický úsek DNA v genomu (enhancery několik kb upstream nebo downstream od promotoru) 2.Kontaktují transkripční aparát (přímo či nepřímo) a dovolují polymeráze opustit promotor a elongovat. 3.Často přísně tkáňově a časově regulovaná exprese TF – nazávislá DNA vazebná a aktivační doména

4 Mediátor komplex 26 proteinů (u člověka) sedící na polymeráze, místo kontaktu většiny specifických transkripčních faktorů Enhancery výtvářejí smyčky na DNA integruje signál z různých aktivátorů a represorů a tlumočí ho polymeráze zprostředkovává vazbu specifických TF a PolII drží polymerázu připravenou na promotoru (poised state), dokuď nedostane signál z cytoplasmy k uvolnění a elongaci CDK8 – složka mediátoru, fosforyluje CTD jako odpověď na vnější signál

5 Jak zabránit aktivátorům na enhanceru, aby regulovaly i vedlejší geny? Jeden enhancer může regulovat i více než jeden gen, ale pak si geny navzájem kompetují. Insulátory sekvence DNA bohaté na GC, které rozdělují chromozom na samostatné regulační oblasti vážou několik kopií IBP proteinů (insulator binding proteins), například CTCF (CCCTC- binding factor) tvoří smyčky na DNA: pouze enhancery uvnitř smyčky mohou ovlivňovat geny uvnitř, aktivita vnějších enhancerů je blokovaná zároveň působí jako obrana proti šíření heterochromatinu

6 Insulátory lze inaktivovat metylací jejich GC vazebných míst Imprinting H19/Igf2 lokusu metylace cytosinů v DMR1, DMR2 a ICR u otce brání vazbě CTCF na insulátor Enhancer se váže na promotor Igf2 genu u matky se díky CTCF vytvoří regulační smyčka znemožňující enahnceru aktivovat Igf2 gen, místo toho zapne H19 gen Paternálně zděděný lokus Maternálně zděděný lokus

7 DNA na chromozomu je organizovaná do smyček, podobně jako u bakterií (300nm struktura) bakterie 40kpb na smyčku, eukaryota kbp jaderná matrix (nuclear matrix) síť filamentárních proteinů těsně pod jadernou membránou MAR protein (matrix attachment regions protein) oblast uchyceni k matrixu (matrix attachment regions, MAR neboli scaffold attachment regions, SAR) sekvence DNA bohaté na A/T, bp, rozeznávají ohyb DNA způsobený v oblastech DNA s mnoha A asociuje s topoisomerázou II, kontroluje kondenzaci smyčky asociace enhancerů, chromatin remodelujících faktorů

8 Negativní regulace transkripce Narozdíl od prokaryot neblokují represory nasednutí polymerázy, ale spíše brání nasednutí aktivátorů nebo iniciaci transkripce, nebo modifikují strukturu chromatinu CDP CAAT displacement protein Exprimovován pod tkáňově specifickým promotorem pouze v embryu, brání příliš brzké expresi H2B genu gen pro testes specifický histon H2B u ježovky váže CTF aktivátor na CAAT box, umožní Oct1 proteinu kontaktovat mediátor a spustit transkipci

9 Mechanismus funkce represorů u eukaryot

10 myoD transkripční aktivátor genů nutných pro specifikaci svalových buněk. bHLH protein vázající se na DNA jako heterodimer s E12 partnerem, oba mají DNA vazebou doménu ID protein může dimerizovat, ale nemá DNA vazebou doménu, myoD se nemůže vázat na DNA (v buňkách, které se nemají stát svaly) ID protein negativně ovlivňuje transkripci, aniž by se vázal na DNA! (G)

11 Heterochromatin x euchromatin Přístupnost chromatinu transkripčním faktorům a polymeráze hraje klíčovou roli při regulaci transkripce heterochromatin hustě kondenzovaná DNA s histony, nepřístupná polymeráze a proto netranskribovaná konstitutivní – ve všech buňkách daného organizmu fakultativní – při tkáňově specifickém umlčování genů euchromatin málo kondenzovaná DNA s histony, přístupná polymeráze a transkripčním regulacím

12

13 Epigenetické modifikace histonových konců Konce histonů H2A,H2B,H3 and H4 vyčnívají ven z nukleosomu a jsou rozeznávány různými enzymy, které je kovalentně modifikují. Histonový kód Kovalentní modifikace slouží jako značky rozeznávané specifickými vazebnými proteiny, které mají vliv na kompaktaci DNA, transkripci, replikaci, rekombinaci, opravy DNA...

14 sumoylation metylace – postupná mono, di, tri metylace

15

16 lysin – acetylace, metylace (mono, di, tri), monoubiquitinace, ADP ribosylace arginin – metylace (mono, di, tri), deiminace (citrulin) serin, threonin, tyrosin – fosforylace serin - palmitoylace prolin - isomerizace

17 Histon modifikující enzymy jsou přinášeny transkripčními faktory nebo rozeznávájí už existující modifikace Kdo modifikuje histony? acetylázy deacetylázy methylázy demethylázy kinázy ubiquitin ligázy isomerázy

18 Acetylace histonů rozvolňuje chromatin Acetylová skupina přidá negativní náboj na histonový konec, ten se odpoutá od sousedního histonu a tím rozvolní okolní chromatin histon acetyl transferázy (HAT), například p300, CBP histon deacetylázy (HDAC) například HDAC1,2,3, Sir2 Chromatin kompaktovaný, méně přístupný, histonové konce se vážou na sousedící histon.

19 Trends in Pharmacological Sciences Volume 31, Issue

20 Histonový kód Specifické modifikace histonů jsou rozeznávány proteiny se specifickými histon vazebnými doménami a další…

21 Způsoby vazby proteinů na modifikované histony

22 Histonový kód je čtený histon vazebnými proteiny

23 aktivační modifikace H3, H4 acetylace H3K4tri-metylace represní modifikace H3K9 tri-metylace H3K27 tri-metylace H4K20 tri-metylace bivalentní domény H3K4tri-metylace + H3K27tri-metylace

24

25 Post-translační modifikace histonů slouží jako signály k regulaci struktury chromatinu a přístupnosti DNA Specifiké modifiace slouží jako značka pro vazbu dalších proteinů, které remodelují histony a strukturu celého chormatinu, což má vliv na přístupnost DNA pro transkripci a další děje. Transkripčně utlumený ‘ hetrochromatin ’ Represivní metylace (H3K9/ K27) histon deacetylázy (HDAC) Aktivační acetylace a metylace (H3K4/ K36/ K79) histon acetyltransferázy (HAT) Transkripčně aktivní ‘ euchromatin ’ Tento ‘kód’ se dědí i po dělení buňky a informace o kontrole exprese jsou tedy předávány ‘ epigeneticky ’

26 EPIGENETIKA = změny genové exprese zachované i po dělení buňky, které ale nejsou primárně kódovány sekvencí DNA posttranslační modifikace remodelace chromatinu imprinting inaktivace X-chromosomu Epigenetické mechanizmy = software DNA = hardware

27 Šíření změn chromatinu podél chromozomu pomocí ‘čtečky’ a ‘zapisovačky’ kódu

28 Bivalentní domény v embryonálních kmenových buňkách Christophersen N S, and Helin K J Exp Med 2010;207: Aktivační (K4trimetylace) i represní (K27trimetylace) modifikace na stejném chromozomu, s polymerázou připravenou k transkripci (poised polymerase). U důležitých vývojových genů, které je třeba rychle zapnout.

29 Kdy dochází k modifikacím chromatinu? 1.během aktivace genů a transkripce 2.při umlčení genů 3.při imprintingu 4.při inaktivaci X chromozomu 5.při opravě DNA 6.při rekombinaci 7.při replikaci DNA

30 Chromatinové modifikace během transkripčního cyklu Vazba aktivátorů na jejich rozpoznávací sekvence v enhancerech genů určených pro aktivaci Aktivátory rekrutují ko-aktivátory jako je mediátorový komplex, acetyltransferázový komplex (např.SAGA), který acetyluje histony okolo počátku transkripce. Také chromatin remodelující komplex (např.SWI/SNF), který posune nebo vytěsní histony kolem počátku transkripce..

31 Rekrutování bazálních TF a polymerázy, sestavení iniciačního komplexu TFIIH fosforyluje Ser5 v CTD doméně PolII. Helikáza rozvine bazí DNA sloužící jako templát pro polymerázu. Monoubiquitinace H2B (Bre1) a následná H3K4 trimetylace histonů okolo místa počátku transkripce (Set1). Uvolnění polymerázy a elongace.

32 NELF a DSIF se vážou na polymerázu některých genů krátce po začátku elongace (promoter proximal pause site), pauzující polymeráza (paused polymerase). Fosforylace Ser2 v CTD, DSIF a NELF díky P-TEF2 (positive transcription elongation factor 2)

33 CTD doména váže během elongace proteiny modifikující chromatin, například SETD2 trimetylující H3K36 a acetylázy. Histony před polymerázou musejí být odstraněny a za polymerázou opět navázány do nuklesomů –díky chromatin remodelujícím komplexům a histonovým chaperonům (např. FACT komplex) Specifické modifikace chromatinu ve specifických místech genu zajišťují, aby transkripce začala na definovaném místě promotoru (a ne třeba uvnitř genu). Modifikace také ovlivňují (alternativní) splicing.

34 M. Smolle, J.L. Workman / Biochimica et Biophysica Acta 1829 (2013) 84–97 oblast bez nukleosomů nukleosomy s H2A.Z variantami nukleosomy s H3.3 variantami

35 Histonové varianty Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích…

36 Histonové varianty Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích… H2A.Z - v nukleosomech obklopujících počátek transkripce většiny genů (-1 a +1 nukleosom) a enhancery - +1 nukleosom je přesně umístěné vzhledem k počátku transkripce, díky chromatin remodelujícím enzymům - stabilní asociace H2A.Z s DNA, pomáhají udržet ‘nukleosome free region’ v místě nasedání polymerázy - neváže histon H1 - acetylovaný pozitivně ovlivňuje transkripci, usnadňuje nasedání polymerázy - H2A.Z bez acetylace, nebo monoubiquitinovaný, je složkou heterochromatinu - někdy jako heterodimer H2A-H2B/H2A.Z-H2B na stejném nukleosomu

37 H2A.Z nukleozomy jsou aktivně umisťovány POUZE kolem počátku transkripce

38 H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány =  H2A.X - fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě reparačních a remodelačních enzymů - remodeling a inaktivace sex chromozomů CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3) CENP-A nukleozom

39 H2A.X – serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány =  H2A.X - fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy v DNA, pomáhá vazbě reparačních a remodelačních enzymů - remodeling a inaktivace sex chromozomů CenH3 – specifická varianta na centromerách, k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3) H3.3 - složkou aktivně transkribovaných genů, enhancerů a promotorů, kde jsou histony aktivně odstraňovány a opět inkorporovány MacroH2A – nehistonová ‘makrodoména’na C-konci - makrodoména může být poly-ADP-ribosylována pomocí PARP1 enyzmu (poly-ADP-rinosyl transferáza), snižuje transkripci a vede k represi genů H2A.Bbd – ‘H2A Barr body deficient’ (chybí na inaktivním X-chromozomu) - chybí C-konec postranslačně modifikovaný u klasického H2A - v transkripčně aktivních genech hlavně v mozku a varlatech Histonové varianty jsou přidávané na DNA až po replikaci DNA, během replikace jsou vždy inkorporovány normální H3.

40 Většina eukryot má pouze jednu formu H4 a H2B (trypanozoma dvě formy od každého histonu) Protaminy - analogy histonů ve spermiích, spolu s histonovými variantami specifickými pouze pro spermie nahrazují většinu normálních nukleosomů a kompaktují genom. Je důležité vymazat epigenetické modifikace otce před oplozením vajíčka.

41 ATP dependentní chromatin remodelující komplexy Nukleosomy mohou bránit přístupu TF a tím bránit transkripci. ‘Pionýrské’ transkripční faktory mohou vázat DNA i na nukleosomech a pomocí chromatin remodelujícíh komplexů odstranit nebo posunout histony kolem počátku transkripce a umožnit tak sestavení iniciačního komplexu.

42 Mechanismus remodelace chromatinu 1. nucleosome sliding

43 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression Volume 1681, Issues 2– Vzájemně se nevylučující mechanismy (remodelling)

44 Nukleozomy existují v dynamické rovnováze, chromatin remodelující enzymy pouze posunují rovnováhu určitým směrem

45 Chromatin remodelující komplexy 4 rodiny: SWI/SNF, ISWI, Mi-2, INO80

46 Pořadí nasedání TF, HAT a remodelujících komplexů se liší od typu promotoru 1.Transkripční faktor váže DNA 2.Histon acetyl transferáza (HAT) se váže na TF 3.HAT acetyluje okolní histony a rozvolní chromatin 4.Chromatin remodelující komplexy se vážou na TF nebo přímo na histony a přesouvají je, aby zpřístupnily DNA 5.Vážou se další transkripční faktory 6.Vazba polymerázy 7.K iniciace je potřeba pozitivní signál od specifických transkripčních faktorů přes mediátorový komplex Nejčastější scénář:

47

48 UMLČOVÁNÍ TRANSKRIPCE (gene silencing) Nature review genetics (12) 2011 BLACK chromatin – zatím prokázán jen v Drosophile, asociovaný s jadernou laminou, 48% genomu, bez HP1 a Polycomb, hodně H1, umlčené geny aktivní během vývoje organizmu Polycomb a HP1 fakultativní heterochromatin BLACK chromatin BLACK chromatin Cílené zastavení transkripce specifických úseků DNA: HP1 and Polycomb silencing specifické histonové modifikace vedoucí ke kompaktaci chromatinu a jeho znepřístupnění pro TF a polymerázu role DNA modifikujících proteinů + metylace DNA

49 Iniciace heterochromatinu vazbou Kruppel associated box domain zinc finger proteins (KRAB-ZFP) Vznik a šíření fakultativního heterochromatinu přes HP1 protein (H3K9 trimetyláza) KRAB KAP1 histon 3 K9 trimetylace Šíření heterochromatinu oběma směry! Velká rodina transkripčních faktorů (asi 350 u člověka), vážou nas sebe KAP1 (KRAB- associated protein1), který je místem k navázání heterochromatin proteinu 1 (HP1) a H3K9 trimetyláz

50 Šíření heterochromatinu přes Polycomb group proteiny PRE – polycomb response element na DNA, váže PRC1, PRC2 nebo PhoRC komplexy 1. Specifické transkripční faktory nebo ncRNA rekrutují PRC2 komplex H3 K27 trimetylace 3. H3 K27 trimetylace umožní vazbu PRC1 komplexu a ubiquitinace H2A K sám PRC2 se váže na H3K27 tri, (šíření heterochromatinu) Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008

51 4. Deacetylace histonů (H3 a H4) 5. metylace DNA Kompaktace chromatinu, brání přístupu dalších chromatin modifikujících proteinů a polymerázy.

52 Poziční efekt (position effect variegation) Šíření heterochromatinu z centromerických nebo telomerických oblastí nebo v blízkosti inaktivovaných transpozonů Bez specifických inzulátorů by se chromatin šířil dále po chromozomu.

53 Polycomb komplexy řídí expresi mnoha vývojových genů Například Hox genů (homeotických genů) Transkripční faktory s homeobox doménou (vazba DNA), řídí expresi genů pro vývoj hlavy, oka, křídel atd. Genové klastry, kde pořadí na chromozomu odpovídá pořadí exprese v embryu = kolineární exprese Geny řídící identititu jednotlivých segmentů embrya podél anterio- posteriální osy Drosophila dva klastry ne stejném chromozomu, vyšší organizmy několik klusterů na různých chromozomech

54 wild type Antp bx Objevené na Drosophile jakožto ‘ homeotické ’ mutace, tedy mutace transformující jednu část těla v jinou (= ‘Antennapedia’ and ‘bithorax’)

55 Exprese homeotických genů působí jako trvalé označení polohy dané buňky podél anterio-posteriální osy Remodelace chromatinu Polycomb group proteiny X Trithorax group proteiny Remodelace chromatinu Polycomb group proteiny X Trithorax group proteiny Ačkoliv exprese homeotických genů probíhá v rané embryogenezi, označí polohu buňky a předurčí ji k vývoji určitým směrem (t.j. k vývoji určitého orgánu) mnohem později během embryonílního vývoje Jak si buňka tuto informaci pamatuje? Posttranslační histonové modifikace The descendent cells now know how they should differentiate despite never actually being exposed to the differentiating stimulus

56 Metylace DNA  u prokaryot metylace označuje nově vzniklé DNA vlákno během replikace  u eukaryot metylace slouží k umlčení genové exprese Metylace cytosinů cytosin 5-metyl-cytosin 10% genomu u živočichů, 30% genomu rostlin

57 krátká rotpoznávací sekvence pro metylázy CG u živočichů, CNG u rostlin udržovací metylázy (pro zachování metylačních značek během replikace) demetylázy de novo metylázy Metylázy a demetylázy Metylázy a demetylázy DNA metylace je stabilní během buněčného dělení.

58 Umlčování genové exprese je často spojeno s metylací DNA MeCP – methyl cytosine binding protein váže se na CH3 skupiny a přináší s sebou deacetylázy kompaktace DNA CH3 skupiny míří do velkého žlábku a brání nasedání transkripčních faktorů Dva mechanizmy bránící expresi genů:

59 CpG ostrovy (CpG islands, CG islands) oblasti s velkou hustotou CG sekvencí asi 40% promotorů leží v blízkosti CpG ostrovů CpG ostrovy neaktivních genů jsou metylované aktivní geny mají CpG sekvence nemetylované (houskeeping geny) tkáňově specifické geny mají sekvence metylované ve tkáních, kde nejsou exprimované, ale nemetylované ve tkáních, kde jsou exprimované nemetylovaná DNA metylovaná DNA

60 Metylační profil většiny genů je vymazán krátce po oplození vajíčka Mechanismus de novo metylace není dobře znám… Několik genů nemá metylační značky vymazány - imprinting

61 Imprinting Metylační značky uniknou vymazání a reprogramovaní během embryogeneze  Igf2 gen zděděný od matky je v somatických buňkách vždy metylovaný (neaktivní)  Igf2 gen od otce je vždy nemetylovaný (aktivní) Pouze při formaci dalších vajíček budou obě alely Igf2 znovu metylované a ve spermiích obě demetylované.

62 Inaktivace X-chromozomu Gen pro barvu srsti leží na X-chromozomu Calico kočka je heterozygotní pro tento gen (druhá alela je mutantní, neprodukuje barvivo) Náhodná inaktivace X-chromozomů Oblasti s bílou srstí mají inaktivovaný X chromozom s normální alelou a aktivní pouze X chromozom s mutantní alelou kočka Calico U savců, hub a rostlin Samec vždy normální hnědý

63 Xist gen (X-inactive specific transcript) leží na X chromozomu nekóduje protein, ale pouze RNA metylovaný a tedy neaktivní na aktivním X chromozomu nemetylovaný a tedy aktivní na neaktivním X chromozomu aktivní X chromozom neaktivní X chromozom aktivní Xist gen metylovaný Xist gen přenesení Xist genu na jiný chromozom stačí k téměř úplné deaktivaci tohoto chromozomu

64 Oba Xist geny se mírně exprimují, stejně jako jejich antisense transkript Tsix Tsix RNA Na aktivním X se začně více exprimovat Tsix, který utlumí expresi Xist = aktivní Tsix Na neaktivním X se začně více exprimovat Xist a utlumí se Tsix = aktivní Xist aktivní X neaktivní X

65 stabilní po zbytek života buňky Xist RNA postupně směrem od Xist genu pokryje chromozom, na kterém se nachází, váže PRC2 komplex, deacetylázy a další chromatin modifikující a DNA metylující proteiny inaktivace téměř veškeré transkripce K27 trimetylace, deacetylace H4, macro H2A histonová varianta Aktivní X: pouze Xist gen je metylovaný a tedy neaktivní, ostatní geny funkční Každá žena je genetická mozaika! Ani jednovaječná dvojčata nemusí být stejná… aktivní X neaktivní X Neaktivní X:

66 Barrovo tělísko Heterochromatin naktivního X chromozomu viditelný pod světelným mikroskopem nebo při imunodetekci H3K27

67 Mapování metylovaných cytosinů v genomu Bisulfidické sekvenování Imunoprecipitace pomocí protilátky proti 5-mC

68 Buněčný metabolismus má výrazný vliv na transkripci Mnoho transkripčních regulátorů potřebuje metabolity pro svou funkci. Trends in Biochemical Sciences November 2012, Vol. 37, No. 11 ATP chromatin remodelling enzymes O2 histon demethylases (JmJC)

69 normální buňka hladovějící buňkarakovinná buňka ATP : ADP NAD + : NADH O2O2 SAM  KG ATP : ADP NAD + : NADH O2O2 SAM  KG ATP : ADP O2O2 SAM  KG NAD + : NADH úroveň metabolismu ovlivní aktivitu proteinů, které potřebují metabolity jako substráty nebo kofaktory ke své činnosti vliv na transkripci, ale i buněčnou signalizaci, replikaci atd. Metabolismus je klíčový regulátor mnoha buněčných dějů

70 metabolism metabolické senzory transkripce signální dráhy replikace regulace exprese metabolických genů buněčný metabolismus (HAT, Sir2, SWI/SNF….) ATP, NAD, acetylCoA, SAM, O2… Mnoho proteinů působí mimo jiné jako metabolické sensory

71 Krejci lab Zorana Vujin Raquel Perez-Gomez Matej Horvath Vera Slaninova Pavel Steffal Vladka Tuckova Laboratoř vývojové biologie a genetiky


Stáhnout ppt "Regulace transkripce u eukaryot (kapitola 17) 5. Molekulární biologie."

Podobné prezentace


Reklamy Google