Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Postranslační děje v buňce Sbalení proteinů pomocí chaperonů Degradace proteinů Kovaletní modifikace proteinů Transport proteinů v buňce.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Postranslační děje v buňce Sbalení proteinů pomocí chaperonů Degradace proteinů Kovaletní modifikace proteinů Transport proteinů v buňce."— Transkript prezentace:

1 Postranslační děje v buňce Sbalení proteinů pomocí chaperonů Degradace proteinů Kovaletní modifikace proteinů Transport proteinů v buňce

2 Po translaci • Protein musí být sbalen do své fuknční 3D podoby • Vazba důležitých kofaktorů • Kovalentní modifikace • Fosforylace • Methylace • Acetylace • Glycosylace • Farnesylace atd. • Sbalení do proteinového komplexu

3 Cytoplasma je neobyčejně koncentrovaný roztok proteinů (300 – 400mg/ml) PROBLEM: jak se čerstvě translatované proteiny maji v pořádku sbalit v tomto vysoce koncetrovaném roztoku, aniž by agregovaly ? Po translaci

4 Chaperony • Mnoho proteinů se neumí sbalit samovolně • Chaperoniny/ Chaperony: • Proteiny, které asistují jiným proteinům a pomáhají jim zaujmout správnou konfromaci • Role spočívá především v zabránění špatného sbalení, než v aktivním napomáhaní • Můžou prodloužit dobu sbalení a tudíž ovlivňovat čas působení proteinu • Můžou také ‚zachránit‘ již špatně sbalený protein, rozbalit ho a umožnit mu zaujmout správnou konformaci

5 Chaperony • Heat shock proteiny • Exprese heat shock proteinů se zvyšuje spolu s teplotou, jelikož při vyšší teplotě je větší šance, že proteiny budou denaturovat a špatně zaujímat svou konformaci • 6 velkých rodin (číslo odpovídá velikosti proteinu) • Hsp60, hsp70, hsp 100, hsp 110 • Mají afinitu k exponovaným hydrofóbním oblastem proteinu, který není finálně sbalen • Hsp 70 • Důležitý pro sbalování proteinů ko-translačně • Hsp 60/GroEL • Pracují s proteiny, které jíž byly plně syntetizovány (po-translačně)

6 1. Hsp70-ATP se váže na hydrofóbní postranní řetězce polypetidového řetězce, který se syntetizuje na ribozómu 2.Vazba peptidu na Hsp70 iniciuje hydrolýzu ATP 3. Hsp70-ADP se silně váže na peptid a zabraňuje jeho agregaci 4. Nucleotide exchange factors eventuálně vymění ADP za ATP a Hsp70-ATP se uvolňuje z proteinu 5. Protein spontánně zaujme svou správnou konfromaci 6. Malé procento proteinů se sbalí špatně Hsp70

7 Hsp60/GroEL • GroEL-GroES z E. Coli • Gro E operon – 2 proteiny GroEL 58Kd, GroES 10 Kda • Aktivní komplex obsahuje 14 podjednotek GroEL a 7 kopií GroES, 10Mda • 2 prstence, které nejsou průchodné • Sbalování proteinu trvá cca 20s, může být opakováno • Jeden cyklus spotřebuje přibližně 7-14ATP

8 1. Špatně sbalený protein s exponovanými hydrofóbními oblastmi se váže na hydrofóbní oblast Multi-subunit complex ‘cocktail shaker’ 2. Vazba GroES čepičky a konformační změny díky vazby ATP uvolňuje navázany protein do lumen GroEL, kde dojde ke správnému sbalení 3. Hydrolýza navázeného ATP (plus další ATP molekuly) uvolní GroEC čepičku a dojde k uvolnění proteinu do cytoplasmy 4. Další špatně sbalený protein se váže na druhou stranu GroEL proteinu Hsp60/GroEL Open konformace Closed konformace Dutina se 2x zvětší a je hydrofilní

9 Monitorování kvality proteinu • Rychle se sbalující proteiny se obvykle sbalí bez problémů • Pomalu se sbalující proteiny – pomoc Hsp proteinů • Pokud proteiny jsou inkompletně sbaleny (po několika pokusech), jsou cíleny k degradaci

10 Obrovský 2MDa velký proteinový komplex, jaderný a cytoplasmatický (26S) 19S regulační část 20S centrální část - katalytická 26S proteasome (cryo-electron microscopy) 20S centrální část je tvořena heptamerickými kruhy, které vytváří dutinu pro bezpečnou degradaci proteinu Strukturní/regulační podjednotka  Proteolyticky aktivní podjednotka β Proteasome

11 Proteasome - unfoldase • Hexamerický kruh regulační oblasti • Unfoldase • AAA proteiny 1.Vazba proteinu určený k destrukci, či rozbalení (tag) 2.ATP dependetní změna jedné podjednotky vtahuje sbalený portein dovntiř a tím ho rozbaluje 3.U stabilních proteinu může dojít až ke stovkám ATP/ADP cyklům než je celý protein vtažen do 20S proteasomu

12 Ubiquitin • Malý 76AA protein • Volný • Záleží na počtu ubiquitinových molekul, jak jsou na sebe navázány (vazba pře Lys48, nebo Lys63) • Vázaný na protein a udává další osud proteinu: • Degradace • Regulace • Endocytóza • DNA oprava

13 Ubiquitinace – značka pro degradace Ubiquitination of condemned proteins requires three enzymes: 1) E1 ubiquitin aktivační enzym hydrolyzuje ATP a váže na sebe jednu molekulul ubiquitinu (tím ho aktivuje) 2) E2 ubiquitin konjugační enzym rozeznává E1 komplex a přenáší ho na sebe

14 Ubiquitinace – značka pro degradace 3) E3 ubiquitin ligáza se váže na substrátový protein a dojde k přenosu ubiquitinu na protein, který má být degradován. Tyto 3 kroky se opakují několikrát

15 Degradace - summary • Krátké peptidy jsou z cytosolu dopraveny do ER, GA a lysozomu • Exotermně rozštípány pomocí peptidáz • Vlastní ubiquitin projde proteasomem nenaštípán, specifická peptidáza ho odštípne a tím ho recykluje

16 Kovalentni modifikace proteinů • 50-90% proteinů v buňce je postranslačně modifikováno • Fosforylace na Ser, Thr, Tyr • Methylace na Lys, Arg • N-Acetylace na Lys • Lipidace • Ubiquitinace na Lys • N-acetylglucosaminace na Ser a Thr

17 Fosforylace • Nejdůležitější potranslační modifikace • Důležitá pro signální dráhy, metabolismus, intracelulární membránový přenos, genovou transkripci, pohyb atd. • PO 2- - negativní náboj, ovlivňuje konformaci proteinu • Vytváří vodíkové můstky s amidovými skupinami AK • Vytváří iontové vazby s kladně nabitými AK • Reverzibilní • 2 enzymy • Fosfatáza – odebírá P • Kináza – přidává P

18 Figure 3-73 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Signál pro ukončení uchovávání glukózy v podobě glykogenu a spouštějící uvolnění glukózy je procesován kinase A. Fosforylace glykogen syntázy ukončuje syntézu glykogenu Fosforylace glykogen fosforylázy vede k aktivaci tohoto enzymu a rozložení glykogenu na glukózu-1- fosfát a začátek glykolýzy. Metabolismus glykogenu je regulován pomocí fosforylace

19 Ukotvení membránových proteinů do membrány • Myristylace – 14-ti uhlíková mastná kyselina • G proteiny (Ras family) • G protein coupled receptors • Palmitylace – 16-ti uhlíková MK • Farnesylace – připojení isoprenoidu Amidová vazba STABILNI Thio-esterová vazba LABILNI Thio-eterová vazba Mastná kyselina Isoprenoidy

20 GPI-modifikace proteinů v ER • Kovalentní modifikace proteinů v ER • Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy • Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce • Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány • U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace – shedding of antibodies

21 GPI-modifikace proteinů v ER • Kovalentní modifikace proteinů v ER • Přidání glykosylfosfatidyl inositolové kotvy • Ukotvení proteinu v membráně pomocí uhlovodíkového řetězce • Proteiny jsou cíleny do plasmatické membrány • U T. brucei – VSG proteiny jsou připojeny pomocí GPI modifikace – shedding of antibodies Vazba může být přerušena phospholipázou – signální molekula C-term hydrofóbní oblast (15 – 20 AK)

22 Methylace • Arg nebo Lys • Modifikace jaderných proteinů • Methyltransferase (substrát je S- adenosylmethionine) • Nevratná (vazba je velmi stabilní, demethylázy nebyly nalezeny) • Methylace nemění náboj, ale mění sterickou konformaci, přerušuje vodíkové můstky • Mění protein-protein interakce • Methylace jaderných ribonukleových proteinů (hnRNPs) • Role v transportu RNA a pre-mRNA processing • Methylace histonů • Lys methylace • Důležité pro regulaci genové exprese, DNA repair, DNA replikaci

23 Acetylace • Lysine • N-acetyltransferase, acetyl skupina je odebrata z acetyl-CoA • Až 1/3 proteinů modifikována • Acetylace N-konce proteinu je nevratná, acetylace lysinu je reverzibilní (deacetylázy) • Mění náboj! • Acetylace histonů – hlavní role v regulaci genvé exprese • Acetylovaný histon – aktivní chromatin

24 Sumylace • SUMO – small ubiquitine related modifier • Vazba na sekvenci  LysXGlu pomocí specifických SUMO aktivačních a konjugačních enzymů • Sumylace proteinů důležitá např. pro buněčný cyklus • Sumylace proteinů může změnit jejich lokalizaci, transkripční aktivitu a stabilitu

25 Figure 3-81a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Postranslační modifikace P53 – tumor supresor, důležitý pro regulaci buněčného cyklu, prevence vzniku rakoviny • v nepoškozených buňkách je p53 rychle degradován díky vazebnému partneru Mdm2 – ubiquitine ligáza • v poškozené buňce dojde k fosforylace, snižení vazby na Mdm2, stabilizace p53, aktivace transkripce Příklad:

26 Post translační modifikace zvyšují možné variace produktu jednoho genu Tato variabilita umožňuje komplexnější regulaci funkce proteinů a také přímo ovlivňuje jejich funkci Postranslační modifikace

27 Transport proteinů v buňce

28

29 Signální sekvence • Signální sekvence určují správnou adresu proteinu v rámci buňky • Signální sekvence • Import do jádra • Export z jádra • Import do mitochondrie • Import do plastidu • Import do peroxisomu • Import do ER • Návrat do ER

30 Transport proteinů do jádra • Jaderná membrána • Vnější a vnitřní • Specifická proteinová kompozice • Perinukleární prostor  lumen ER • Jaderný pór (50 – 10nm) • Malé látky + proteiny do 50Kda volně procházejí • Větší proteiny – signál nukleární lokalizace

31 Jaderný pór • Nuclear pore complexes NPCs • 125MDa • 30 podjednotek – nukleoporiny • Oktagonální symetrie • Každé jádro obsahuje okolo 3000 – 4000 NPCs • Každý NPC přenese až 500 molekul/sec • Přenos je obousměrný • Pasivní přenos – difúze • Aktivní (NLS)

32 Signál nukleární lokalizace • Pomocí mutací velmi přesně definován • Signál je rozeznáván pomocí jaderných importních receptorů • Alespoň 3 kladně nabité AK s prolinem v blízkosti

33 Obousměrnost pohybu • Jaderný import signál vs jaderný export signál • Importní receptory vs exportní receptory • RAN GTPase • Cytosolický Ran-GTPase Activating Protein • Jaderný Ran-Guanine Exchange Factor • Gradient Ran-GDP/Ran-GTP

34 Obousměrnost pohybu 1. Protein se NLS se váže na cytosolický importní receptor a pomocí fibril s FG motivy prochází pórem 2. Ran-GTP se váže a způsobuje uvolnění proteinu 3. Receptor spolu s Ran- GTP je transportován zpět do cytosolu, kde dojde k defosforylace a uvolnění těchto dvou molekul IMPORT EXPORT

35 Cytosol - ER • Endoplasmatické retikulum • Síťový labyrinth tubulů a váčků • Až 10% objemu buňky • Import do ER je ko-translační

36 ER import • Po syntéze prvních cca 70AK se objeví signální sekvence (cca 25-30AK s centrálními 8 – 10 nepolárních AK) • SRP – signální rozeznávací částice • Tyčkovitá molekula • 6 podjednotek + 7S RNA Hydrofóbní kapsa - methionin AK, váže SS (p54) Doména způsobující přestávku v translaci (p9/p14) p68/p72 – vazba specifický receptor

37 ER import 1. Vazba SRP na signální sekvenci 2. SRP receptor váže SRP a usměrňuje ho směrem k translokátor 3.SRP částice je odpojena ve chvíli, kdy je ribozóm navázan na translokátor, pokračuje v translaci a protein prochází do vnitř ER

38 ER import – rozpustné a membránové proteiny 1. Signální sekvence funguje jako translokační signál 2. Signální peptidáza odštěpuje sekvenci a protein je uvolněn do lumen ER 1. Translokační signál 2. Signál zastavující translokaci i.Pokud je blíže C-term konci – C‘ konec bude v cytosolu (typ I) ii.Pokud je blíže k N-term konci, N‘ konec bude v cytosolu (typ II) 3. Translokátor mění svou konformaci, dochází k uvolnění proteinu do membrány 3. degradace signální částice

39 Glykosylace proteinů v ER • Většina proteinů v lumen ER je určena k exportu • Pokud protein má zůstat v ER – retenční signál na C‘ konci (KDEL, 4AK) • Glykosylace probíhá v ER (až 50% proteinů v buňce je glykosylováno) • N-glykosylace (v 90% procentech) Oligosacharid 14 molekul N-linkage Core region

40 • Oligosaccharyl transferase (enzymatický komplex) • Dolichol (lipid) Glykosylace proteinů v ER High energy pyrophosphate bond Single enzymatic step

41 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Glykosylace proteinů v ER • Kontrola kvality

42 Vesikulární transport

43 Glykosylace v Golgi • N-glykosylace v ER, odstranění glukózy a manózy • Modifikace v Golgi – funkční dopad • Všechny enzymy v Golgi jsou membránové (oproti ER) • Glucosidázy, manosidázy • Glycosyl, galactosyl, sialyl l transferázy Sialyl transferáza Galaktosyl transferáza Mannosidáza II Mannosidáza I GlcN transferáza

44 • 2 hlavní skupiny oligoscharidů u savců • Complex oligosaccharide • High-mannose oligosaccharide Glykosylace v Golgi

45 O-linked glycosylace • V Golgi • Cukr ke přidán k –OH skupině serinu, či threoninu • Příklad: muciny, komponenty extracelulární matrix, Notch, ochranný kabát • fication_eng.mp4 fication_eng.mp4

46 Transport proteinů do mitochondrie • Během sekund a minut po translaci • Transportovány post-translačně • Signální sekvence na N‘ term  matrix • Interní signální sekvence  IM, IMS, OM

47 Mt signální sekvence • Obvykle 20 – 25 AK • Nepolární nenabité AK, přibližně každá čtvrtá AK je Arg, či Lys • Amfipatický alpha helix Jedna strana je pozitivně nabita Druhá je nepolární

48 Přenos proteinu do mitochondrie • TOM complex • TIM 23 complex – import matrixových proteinů • TIM 22 complex – import IM proteinů • SAM complex – import OM proteinů • OXA complex – import mt kódovaných proteinů

49 Mt signální sekvence

50 Přenos proteinu do matrix mitochondrie • Vyžaduje ATP a to na cytosolické a matrixové straně • Vyžaduje membránový potenciál Cytosolický ATP napomáhá vazbě SS na TOM, pak se odpojuje SS postupuje směrem k Tim23 SS je translokována do matrix, tento proces vyžaduje MP Protein je vtahován mtHsp70 za hydrolýzy ATP

51 • Přes Tim23 – signální sekvence a stop-transfer sekvence (hydrofóbní) • Pomocí Oxa1 komplexu • Přes Tim22 Přenos proteinu do IM a IMS

52 • Podobný mitochondriálnímu transportu • Postranslační • Vyžaduje energii (ATP) • Používá amfipatický helix • Translokátory (mají jinou kompozici než mt TOM a TIM komplexy • Přenos přes vnitřní membránu není poháněn gradientem H+, ale GTP/ATP hydrolýzou • Transport do thylakoidů je závislý na gradientu H+ Přenos proteinu do chloroplastu

53

54 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Přenos proteinu do thylakoidu 1. Sec dráha používá homologní translokátory jako baktérie 2. Homolog signální rozeznávací částice (ER) 3. Import závislý na přítomnosti dvou Arg v signální sekvenci 4. Spontánní dráha

55 MOLECULAR BIOLOGY – Protein structure & function Enzymes can modify proteins by the addition of molecular moieties i.e. ‘ post-translational modifications ’ PhosphorylationGlycosylationMethylation N-acetylation N-myristoylationDeamination S-prenylationSumoylationS-pamitoylation GPI-anchoringLipidation Ubiquitination S-NitrosylationLipidation Although the genetic code specifies for the incorporation of only 20 amino acids into proteins, these can be extensively modified to confer differing functionalities by:


Stáhnout ppt "Postranslační děje v buňce Sbalení proteinů pomocí chaperonů Degradace proteinů Kovaletní modifikace proteinů Transport proteinů v buňce."

Podobné prezentace


Reklamy Google