Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Enzymová kinetika •studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek •zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Enzymová kinetika •studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek •zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných."— Transkript prezentace:

1

2 Enzymová kinetika •studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek •zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: •koncentrace substrátů •koncentraci enzymu •Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...) •Přítomnost aktivátorů a inhibitorů Proč studovat enzymovou kinetiku? •Charakterizace substrátové preference enzymů •Identifikace a studium inhibitorů

3 Typy enzymových reakcí Jednosubstrátové reakce •Jeden substrát  jeden produkt (isomerasy) •Jeden substrát  dva produkty (lyasy) •Jeden substrát a voda  dva produkty (hydrolasy) Dvousubstrátové reakce •Dva substráty  dva produkty (oxidoreduktasy, transferasy) •Dva substráty  jeden produkt (lyasy) Třísubstrátové reakce •Dva substráty a ATP  jeden hlavní produkt a dva produkty z ATP (ligasy)

4 Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu •V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na fruktosu enzymem  fruktofuranosidasou: •sacharosa + H 2 O  glukosa + fruktosa •Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární

5 Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu •Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická

6 Enzymová kinetika Maud MentenLeonor Michaelis

7 Enzymová kinetika – matematické odvození Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci: S ===> P Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S] Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce

8 Rovnice Michaelise a Mentenové k 1 k cat E + S ES ===> P + E k -1 Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES) K 1 je rychlostní konstanta pro tvorbu ES (rychlost = k 1 [E][S]) K -1 je rychlostní konstanta pro disociaci ES (rychlost = k -1 [ES]) Celková rychlost reakce je:

9 Rovnice Michaelise a Mentenové Nemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit. •Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady: 1.Předpokládáme, že k 1 a k -1 jsou podstatně větší než k cat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze. V rovnováze je rychlost tvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže: k 1 [E][S] = k -1 [ES] Po úpravě: kde K S je definována jako rovnovážná disociační konstanta.

10 Rovnice Michaelise a Mentenové 2.Předpokládáme že počáteční koncentrace substrátu [S] o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E] tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa): tj..[S] o >> [E] tot takže[S] ≈ [S] o Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.

11 Rovnice Michaelise a Mentenové Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže: [E] tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (zavedení K S ): Přeskupení: Tedy: E + S ES ===> P + E

12 Rovnice Michaelise a Mentenové Toto je rovnice hyperboly. Pro [S]  v  k cat [E] tot kterou definujeme jako v max. Máme tedy: kde v max = k cat [E] tot (Připomenutí: [S] ≈ [S] o a v je počáteční rychlost reakce.) [S] = Low → High zero order 1st order

13 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Nemůžeme předpokládat, že k 1 a k -1 jsou vždy větší než k cat Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S] o >> [E] tot ) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní. Steady state Time v or [ES] Předpokládáme tedy: Reakční schéma je: k 1 k cat E + S ES ===> P + E k -1 reakční rychlost v = k cat [ES]

14 Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu S P E ES Reaction Time Concentration

15 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Úprava: Tedy: kde K M je známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta. Pokud k -1 >> k cat, K M  K S (= k -1 /k 1 ). k 1 k cat E + S ES ===> P + E k -1 Steady state Time v or [ES] k 1 [E][S] = k -1 [ES] + k cat [ES]

16 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup: Enzym není spotřebován: [E] tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (z výrazu pro K M ): Úprava: Tedy: kde v max = k cat [E] tot.

17 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím: Michaelis-Menten Briggs-Haldane v o = V max [S] K m + [S]

18 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea B-H poskytuje obecnější rovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme: Graf 1/v proti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí K M /v max a úsekem na ose y o hodnotě 1/v max 1/v 1/[S] K M /v max 1/v max Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot -1/K M

19 K m = [S] K m + [S] = 2 [S] V max 2 = V max [S] K m + [S] K m : Afinita vůči substrátu If v o = V max 2 S2 S1 S3 S1 S2 S3 V max 1/2 When using different substrate Affinity changes KmKm v o = V max [S] K m + [S]

20 Důležitost K M •Nezávisí na koncentraci enzymu •Závisí na reakčních podmínkách •Hlavní substrát má nejnižší K M •Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 K M

21 KMKM

22 K m : příklad hexokinasy Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP GlukosaAllosaManosa Substrát číslo K m = 8 8,000 5 mM CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH

23 Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, k cat (vo)(vo) E + S ES E + P k2k2 k1k1 k cat k cat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednu sekundu

24 Číslo přeměny vybraných enzymů Katalasa H 2 O 2 Karbonát-hydrolyasa HCO 3 - Acetylcholinesterasa Acetylcholin 40,000, , ,000 b-Laktamasa Benzylpenicilin 2,000 Fumarasa Fumarát 800 EnzymySubstrát k cat (s -1 ) Počet molekul produktu získaného ze substrátu jednou molekulou enzymu za sekundu Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

25 Jak stanovit K M a V V max KmKm S vovo 1/S 1vo1vo Double reciprocalDirect plot 1) 1) použij známé množství enzymu → E 2) 2) přidej substrát v různých koncentracích → S (osa x) 3) 3) změř produkt v určeném čase (P/t)→ v o (osa y) 4) 4) (x, y) graf, hyperbolická křivka, limita → V max 5) 5) pokud y = 1/2 V max spočti x ([S]) → K m 1 V max - 1 K m 1/2

26 Jednotky enzymové aktivity Reakční doba (min) Produkt [P] směrnice tan S → P m mol v o = [P] / min Unit = Jednotky aktivity Protein (mg) t m mol / min y x yxyx = tan Specifická aktivita =

27 k cat / K m (katalytická účinnost) c hymotrypsin u O R O H 3 C–C–N–C–C–O–CH 3 H H = – = –– –HGlycin k cat / K m 1.3 ╳ –CH 2 –CH 2 –CH 3 Norvalin 3.6 ╳ 10 2 –CH 2 –CH 2 –CH 2 –CH 3 Norleucin 3.0 ╳ 10 3 –CH 2 – Phenylalanin 1.0 ╳ 10 5 (M -1 s -1 ) R = Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

28 Jak zvýšit rychlost reakce • přídavek enzymu (zvýšení [E] tot ) • přídavek substrátu (zvýšení [S]) • modifikace enzymu (optimalizace k cat nebo K S ) v o = V max [S] K m + [S]

29 Kinetika vícesubstrátových reakcí •Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty •Reakce může probíhat různými mechanismy

30 Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný •Vazba prvého substrátu A  změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení)  vazba druhého susbtrátu B  (volný enzym má pro něj malou afinitu)  vznik komplexu EAB •Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty) •Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu •Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD +)

31 Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný •Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů •Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům

32 Mechanismus ping-pongový •Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt •Substrát předá nějakou skupinu  enzym se uvolní v pozměněné formě •Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu •Poté uvolnění produktu a obnova enzymu •Transferasy


Stáhnout ppt "Enzymová kinetika •studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek •zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných."

Podobné prezentace


Reklamy Google