Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)

Prezentace na téma: "Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)"— Transkript prezentace:

1 Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)

2 Polyakrylamidový gel a elektroforéza (PAGE) Zjištění molekulární hmotnosti zeleně fluoreskujícího proteinu (GFP)

3 1.Příprava vzorků pro elektroforézu v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Úkol 1: Zkontrolujte, jestli zkumavka (P) v UV-záření zeleně fluoreskuje!

4 1.Příprava zkumavky pro PAGE 1.1 Napipetuj 10 µl nanášecího pufru (Lämmli pufr) do vaší zkumavky (P). 1.2Zamíchej obsah zkumavky(P).

5 2. Příprava gelových kazet. 2.1 Otevři sáček s PAGE-gelem v místech vyznačených černou čárou a vyjmi gelovou kazetu.

6 2.2Odřízni skalpelem (nebo žiletkou) vyznačenou pásku na kazetě a stáhni spodní pruh. 2. Příprava gelových kazet

7 3.1 Vlož gelovou kazetu do elektrodového držáku kratší stranou dovnitř. Na druhou stranu stojanu dej další gelovou nebo prázdnou kazetu, také kratší stranou dovnitř. 3.2 Přesuň elektrodový držák s kazetami do upínacího rámečku se svorkami, upevni svorky. 3.3Vlož upínací rámeček do elektrodové vany. 3.4Vytáhni hřebínek. 3. Příprava komory pro elektroforézu

8 4.1Do komory mezi skly v elektrodovém držáku nalij TGS-pufr (elektrodový pufr) - až po okraj. 4.2Naplň elektrodovou vanu 200 ml TGS-pufru. 4. Naplnění komory pufrem.

9 Proteinový standart Kaleidoskop Proteinový standart Kaleidoskop Vzorek 5. Naplnění gelových jamek (levá a pravá jamka zůstane prázdná!) Jamky v gelu naplň: - 15 µl proteinového standartu Kaleidoskop (K). - 15 µl vzorku ze zkumavky (P).

10 6.1Zavři elektroforetickou aparaturu a zapni elektroforézu na 200 V. 6.2Zastav elektroforézu, jakmile bromfenolová modř doputuje ke spodnímu okraji gelu. 6. Provedení elektroforézy

11 7.1Vyjmi upínací rámeček s komorou a přelij pufr do elektroforetické vany. 7.2Sejmi gelovou kazetu. 7. Sejmutí gelu

12 8. Analýza 8.1Vložením pod zdroj UV-záření zviditelni GFP-pruh.

13 ColourkDa Blue250 kDa Violet150 kDa Blue100 kDa Magenta75 kDa Blue50 kDa Green37 kDa Magenta25 kDa Blue20 kDa Blue15 kDa Yellow10 kDa Schéma: Molekulární hmotnosti Standartu Kaleidoskop 8. Analýza 8.2Urči molekulární hmotnost GFP pomocí standartu Kaleidoskop