Problémy spojené s kultivací in vitro

Prezentace na téma: "Problémy spojené s kultivací in vitro"— Transkript prezentace:

1 Problémy spojené s kultivací in vitro

2 rekalcitrance Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na změněné kultivační podmínky (recalcitro = přístup odpírám, vyhazuji – o koni).

3 Rekalcitrantní genotypy
Příčiny jsou spatřovány v ekologické konstituci rostlinného materiálu (donora), manipulacích invitro a stresorech in vitro.Vážný problém v biotechnologii. Hypotéza: neexistují (jen zatím nevíme jak na to)

4 Symptomy in vitro 1. Atypická anatomie, morfologie a fyziologie - miniaturizace • změna stavby listů a jejich funkce (uzavřený prostor), pokožka s nízkým obsahem pektinu a celulózy, s nedostatečně vyvinutou kutikulou Nefunkční průduchy • opuchlé výhony • listy bledě zelené nebo šedomodré • listy podlouhlé nebo páskovité • křehké • krabacené nebo zkroucené

5

6 listy průsvitného (skelného) vzhledu - vitrifikace
Sklovitý až průhledný vzhled Hyperhydricita pletiv a orgánů křehkost

7 http://www. hort. purdue

8 Grigoriadou1, 2007

9 Etylén Oxid uhličitý Vodní páry Komponenty média (cytokininy, sacharóza, dusík) Vysoká teplota

10 Jak překonat? Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar) Změnit poměr amonia: nitrátu Snížit hladinu cytokininů na minimum ventilovat

11 Srovnání atmosféry Skleník in vitro kultura O2 21 % jen 4 %
CO % až 20 % H2O % %

12 Jak překonat? Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar) Změnit poměr amonia: nitrátu Snížit hladinu cytokininů na minimum Ventilovat Zvýšit intenzitu světla (fotosyntézu) Snížit teplotu a vlhkost

13

14 2. Redukce apikální dominance
Zkrácená internodia výhonků Růžicovitý růst shluky výhonů při mikropropagaci

15

16 Somaklonální variabilita
Příčiny zvyšující SV: Dlouhá expozice fytohormony (!2,4-D) Dlouhé intervaly mezi subkulturami Větší riziko při tvorbě adventivních než při množení z axilárních pupenů (a meristémů) Rhododendron

17 3. Narušení tvorby kořenů
nadměrná produkce adventivních kořenů špatná tvorba adventivních kořenů

18 4. Nežádoucí nadprodukce a oxidace fenolických látek
Hnědnutí média Odumírání explantátu

19 Proč vzniká? Obranná reakce proti možnému vniknutí infekce
Fytotoxické substance

20 Jak se nežádoucí nadprodukci fenolických látek bránit?
časté pasážování (tekuté medium) počáteční kultivace v chladu, v klidu příměsi do media (AU – aktivní uhlí, PVP - polyvinylpyrolidon…)

21 Jak se bránit nežádoucí oxidaci fenolických látek?
Preparace pod hladinou vody nebo antioxidační směsi AOX (10% k.citronová a 15% k. ascorbová) inkubace explantátů (5-30 min v AOX směsi) počáteční kultivace v chladu, v klidu příměsi do media (AA – kyselina ascorbová)

22 Pupenové kultury dřevin

23

24

25 Hormonální regulace mikropropagace z pupenů
CK CK CK (AUX) AUX AUX (AUX) (AUX) (bez RR) (GA)

26 Postup - založení pupenové kultury dřevin
1/ důkladné promytí tekoucí vodou 2/ propláchnutí 70% ETOH 3/ povrchová sterilizace 15 min 20% SAVO na třepačce 4/ propláchnutí sterilní dest. vodou (3x) 5/ odstranění krycích šupin (* antioxydační směs kys. ascorbové 10% a citronové 15%) 6/ odříznutí pupenu s 2 mm lodyhy (*) 7/ přenesení do zkumavky - popis