Určení rodičů (analýza paternity)

Prezentace na téma: "Určení rodičů (analýza paternity)"— Transkript prezentace:

1 Určení rodičů (analýza paternity)

2 Techniky Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA
Dnes převážně mikrosatelity Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting

3 mikrosatelity Tandemová opakování krátkých motivů Např. (CTTT)n
Někdy i složitější (CTTT)n (CA)n Vysoce polymorfní Jednoduchá dědičnost Využití: analýza paternity, identity, populační struktury… CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

4 PCR Polymerase chain reaction (jak z málo DNA udělat hodně)

5 PCR Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá.
Co se bude množit? To určí primery. Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer DNA templátu tento úsek se bude množit

6 Při ochlazení dojde k reasociaci
Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Při ochlazení dojde k reasociaci

7 Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu
Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst

8 V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena
Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle °C) V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena

9 Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu)

10 Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken

11 Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty

12 Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií

13 Při dalším zahřátí…

14 Ochlazení – nasednutí primerů
72°C vznik nových fragmentů 95°C denaturace

15 Alely se liší délkou CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC + CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

16 Fragmentační analýza Probíhá v sekvenátoru

17

18 Elektroforéza kapilára gel

19 Elektroforéza kapilára gel laserový paprsek detektor

20 primer primer primer primer Fluorescenční značení
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA Fluorescenční značení CTTTCTTTCTTTCTTT primer primer GAAAGAAAGAAAGAAA

21 Multiplex Více dvojic primerů v jedné reakci Různé značení
Analýza se standardem standard

22

23 Určení paternity Matka Otec Mládě 1 Mládě 2

24 Určení paternity prostým vyloučením
(simple exclusion)

25 genotypy Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130
188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 Možní otci  73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217

26 Identifikace mateřských alel u mláďat (na prvním lokusu málo alel – nebudeme se jím zabývat)
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217

27 Zjištěni shody otcovských alel s alelami sociálního partnera → nalezení mimopárových mláďat
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217

28 Dohledání genetických otců mimopárových mláďat mládě 57
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217

29 Dohledání genetických otců mimopárových mláďat mládě 59
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4 55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439 56 Matka 195 254 196 232 233 297 57 230 212 267 58 59 184 204 273 60 73 94 200 243 305 379 1004 256 264 224 228 1005 274 180 245 289 1006 176 234 347 410 1007 146 214 25 168 301 1003 217

30 Databáze na internetu

31 DATABÁZE PROGRAMY Primární databáze DNA sekvencí GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko) BLAST Na stránkách NCBI, Ensembl BLAT Na stránkách USCS Primer3 – navrhování primerů In Silico PCR RepeatMasker Databáze genů Entrez Gene RefSeq Databáze genových expresních dat UniGene GEO Důležité odkazy NCBI - tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST… ENSEMBL - Genome Browser, BLAST USCS – Genome Browser, BLAT, In Silico PCR Databáze genomů NCBI Ensembl UCSC Genome Browser

32 FASTA >gi|gi-number|gb|accession|locus – description GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG

33 GenBank Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci: Locus
Základní vlastnosti sekvence (název, délka, typ) Definition Výpis genů v sekvenci Accession Databázové přístupové číslo Version Verze dané sekvence Keywords Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít Source organism Zařazení v systému Reference Článek, kde byla daná sekvence publikována Features Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic Origin Sekvence

34 Sekvence v genetické bance
Jsou známy nějaké sekvence mamuta? Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence? (nejlépe cytochrom b) NCBI National Centre for Biotechnology Information

35 Čemu je tato sekvence podobná?
Chceme-li vyhledat sekvenci nejpodobnější k námi osekvenovanému neznámému vzorku, využijeme BLAST, opět na stránkách NCBI

36 BLAST Hledá lokální (částečné) podobnosti
Basic Local Alignment SearchTool =========================================== Hledá lokální (částečné) podobnosti Na rozdíl od klasického alignmentu umožňuje velmi rychle a efektivně prohledávat velké databáze

37 Úloha Ze zbytků potravy medvěda v Pyrenejích jsem získal dvě sekvence. Čemu jsou tyto sekvence podobné? >sekvence1 atgaccaatattcgaaaaactcacccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgacctcccagctccgtcaaacatctcatcatgatgaaactttggctccctcctaggcatctgc >sekvence2 ctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagcctt cataggctatgtcctcccgtgaggacaaatatcattctga Postup: Na stránce NCBI zadám, že chci použít BLAST. Pod možnostmi Basic BLAST vyhledám nucleotide BLAST a zadám tuto možnost. Do okénka vložím sekvenci například ve FASTA formátu. V možnosti Database zadám Others. Spustím BLAST.