CHARAKTERIZACE DNA.

Prezentace na téma: "CHARAKTERIZACE DNA."— Transkript prezentace:

1 CHARAKTERIZACE DNA

2 CHARAKTERIZACE DNA QANTUM = kolik? KVANTIFIKACE QUALIS = jaký?
KVALIFIKACE SPECIES = druh SPECIFIKACE Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius

3 Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.

4 Kvantita - několikero vzorečků
MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da] MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da] PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA) pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp) µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4 PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA) pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b) µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4

5 Obsah DNA v buňce Celková DNA 6 pg Celková RNA 10-30 pg
Velikost genomu 2 x 3,3.109 bp Plazma Erytrocyty Leukocyty Trombocyty Počet v ml krve - 5. 109 Obsah DNA v ml krve něco málo… 30-60 µg Objem 2 a více ml koncentrace spermií 20 milionů v ml a více Obsah DNA v ml spermatu 60 µg a více

6 Kvalita DNA - degradace
fragmentace narušení struktury

7 Kvalita DNA - degradace

8 Kvalita DNA - inhibitory

9 specifita DNA

10 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla procházejícího roztokem DNA Tλ = Ip / IV Aλ = -log Tλ = ελ · c · l Lambert – Beerův zákon transmitance absorbance

11 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Absorpční maximum DNA λ = 260 nm

12 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč? malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí) nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA) k měření jsou třeba velká množství izolátu

13 LUMINISCENCE MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“
CHEMO- TERMO- ELEKTRO- KATODO- SONO- MECHANO- FOTO-

14 FOTOLUMINISCENCE fluorescence fosforescence

15 DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze (emmax  470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.

16 DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
ethidiumbromid SYBR green

17 Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie
PICO Green OLIGO Green

18 detekce specificky lidské DNA
Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě

19 Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting
izolát blotujeme na membránu hybridizujeme se specifickou sondou sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1 QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit

20 Kvantifikace specificky lidské DNA - luminometrie
Alu-repetice (???) AluQuant™ Human DNA Quantitation System denaturujeme dsDNA na ssDNA hybridizujeme se specifickou sondou přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je odbourána, vznikají volné dNTP fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci

21 real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!

22 real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!

23 real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Emisní filtr Detektor Excitační Filtr Zdroj světla

24 real-time PCR kvantifikace – možné principy
nespecifické interkalační fluorofory SYBR green, EtBr hydrolyzační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) hybridizační sondy LightCycler

25 real-time PCR kvantifikace
nespecifické interkalační fluorofory provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu) současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye) čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!

26 real-time PCR kvantifikace – Sybr green

27 real-time PCR kvantifikace
hydrolyzační sondy hybridizační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) LightCycler využívají tzv. FRET = Fluorescent (Förster) Resonance Energy Transfer λexcitA λemisA λemisB λexcitA Dye A Dye B

28 real-time PCR kvantifikace - TaqMan

29 real-time PCR kvantifikace - maják

30 real-time PCR kvantifikace - štír

31 real-time PCR kvantifikace - LightCycler

32 real-time PCR kvantifikace
plató exponenciální fáze CT

33 real-time PCR kvantifikace

34 real-time PCR kvantifikace

35 real-time PCR kvantifikace mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak?
neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR kvantifikovaný lokus kontrolní lokus